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    避免踩坑,注意别踩DNA测序里的大坑!

    发布时间: 2021-08-27  点击次数: 1594次

    DNA 测序技术自从发明以来,作为一种重要的分子生物学手段,正在科研和临床上得到了越来越广泛的应用。下面,介绍一下DNA测序里的大坑。给大家一个前车之鉴吧。


    坑一:信号衰减/中断

    测序信号衰减和中断,是测序过程中的常见问题,原因多种多样:模板中含有重复序列,模板中含有高级结构,模板中 GC 含量过高等,都会使得测序信号衰减和中断。另外,引物的质量不好,试剂失活了,都会造成这种问题。解决的方法:反其道而行之,采用反向引物来进行测序,然后通过序列拼接获得全长。有时候就象做拼图游戏。大家 have fun 吧。这里,教大家一个小窍门:在这个过程中,可以适量地加入 DMSO,并且进行扩增。


    坑二:重叠峰/乱峰

    这个问题一般是由于序列前面有连续的碱基,或者是引物的碱基缺失了。如下图所示,模板中有单一位点的碱基缺失,碱基缺失导致测序结果移码。

    避免踩坑,注意别踩DNA测序里的大坑!

    现在有很多测序公司,号称可以帮助设计引物;号称引物是 PAGE 级别的。这里,严重不推荐哈。最好还是自己动手,丰衣足食。解决办法:自己设计引物;自己合成引物;自己将引物进行 PAGE 纯化。反正就是掌握一个原则:自己动手,丰衣足食。


    坑三:Ploy 结构

    有的时候,我们会遇到 Poly 结构,就是 G/C rich,G/C Cluster,Poly A,Poly T 结构等。这种结构的测序容易出现移码现象,导致测序信号衰减和中断(如下图)。解决方法:还是反其道而行之。采用反向引物对模板进行测序,测到该 poly 结构处,进行拼接,不就可以获得序列全长嘛。

    避免踩坑,注意别踩DNA测序里的大坑!


    坑四:空载体

    原因为:目的片段插入失败,或者培养过程中目的片段丢失。解决方案:重起炉灶。重新挑选单克隆,进行 PCR 后,再送去测序。


    坑五:测序结果和文献资料不一样

    这个会以为是实验哪里出问题了,或者是测序公司那里出问题了。这个问题是没有办法滴。同一种动物,不同的种族,甚至不同的个体,基因序列都不一定完全一样。如果是 PCR 产物克隆测序,那还有 PCR 过程中的错配因素等等。

    一般比较正规的测序公司,提供的测序结果都是忠实结果,和文献序列不一样,也就只好不一样啦。


    坑六:重复序列

    如下图所示,好看吧?好看是好看,但是真的看到这个结果,可能就要哭鼻子了。可能的原因:样品中就含有重复序列,结果导致:测序结果和 Poly A/T 的结果一样。这也会导致 Frame 滑动,结果出现移码。

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    解决办法: 还是反其道而行之,反向测序。有时能够顺利的通过重复序列区域,但是有时候又不一定能够。全靠运气吧。如果能够的话,通过多次的测序结果比对,还是做拼图游戏吧,拼接可以得到全序列结果。

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