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    DNA 甲基化测序常用方法

    发布时间: 2021-08-26  点击次数: 343次

    随着高通量测序技术(NGS)技术的发展,使我们能够从全基因组水平来分析 5’甲基胞嘧啶及组蛋白修饰等事件,由此能够发现很多传统的基因组学研究所不能发现的东西,这就是所谓的“DNA 甲基化测序"!


    DNA 甲基化测序方法按原理可以分成三大类: 

    1、重亚硫酸盐测序; 

    2、基于限制性内切酶的测序; 

    3、靶向富集甲基化位点测序; 


    基于以上原理又有数种不同的测序方法,下面,就介绍 10 种 DNA 甲基化测序的常用方法:


    1) 重亚硫酸盐测序 

    该方法可以从单个碱基水平分析基因组中甲基化的胞嘧啶。首先,利用重烟硫酸盐对基因组 DNA 进行处理,将未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基变成尿嘧啶。而发生了甲基化的胞嘧啶未发生脱氨基,因而,可以基于此将经重亚硫酸盐处理的和未处理的测序样本进行比较来发现甲基化的位点。


    2)重亚硫酸盐处理后接头标记技术(PBAT) 

    为了避免重亚硫酸盐处理时模板的丢失,通常会在重亚硫酸盐处理后进行接头连接和随机引物的扩增。


    3)限制性内切酶-重亚硫酸盐靶向测序(RRBS) 

    该技术是指对基因组上 CpG 岛或 CpG 甲基化较密集的区域进行靶向测序。样本首先经几种限制酶进行消化处理,然后经重亚硫酸盐处理,最后再测序。这种方法可以发现单个核苷酸水平的甲基化。


    4)氧化-重亚硫酸盐测序(oxBS-Seq) 

    5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)是 5’甲基胞嘧啶脱甲基成胞嘧啶过程的中间产物,重亚硫酸盐测序无法对二者进行区分。通过氧化-重亚硫酸盐测序,5’甲基胞嘧啶保留,而 5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)被氧化,进而脱氨基成尿嘧啶。通过将经过氧化处理和未处理的样本进行测序比较,即可从单个碱基水平分辨 5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)和 5’甲基胞嘧啶。


    5)TET 辅助的重亚硫酸盐测序(TAB-seq) 

    TAB-seq 采用葡萄糖亚胺与 5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)作用来保护免受 TET 蛋白的氧化。5’甲基胞嘧啶和未甲基化的胞嘧啶被脱氨基成尿嘧啶,进而可以从单个碱基水平鉴定 5’羟甲基胞嘧 啶(5’hmC)。


    6)甲基化敏感性的限制酶测序(MRE-Seq) 

    MRE-Seq 将甲基化作用的敏感性和限制酶的特异性结合起来进而鉴定 CpG 岛的甲基化状态。


    7)HELP-Seq 

    HELP-Seq 采用 HpaII 及其甲基化不敏感的限制性内切酶 MSPI 处理,来对基因组内及基因组间的甲基化位点进行比较,进而实现甲基化测序。


    8)甲基化 DNA 免疫共沉淀测序(MeDIP) 

    MeDIP 是一种采用抗体或甲基化 DNA 结合蛋白来捕获富集甲基化 DNA 的技术,这种技术可以发现基因组中高度甲基化的区域,如 CpG 岛,但不能进行单个碱基水平的分析。


    9)甲基化结合域捕获技术(MBD-CAP) 

    MBD-CAP 技术利用甲基化 DNA 能够结合蛋白 MeCP2,MBD1-2 和 MBD3LI 来对甲基化的 DNA 进行免疫沉淀。与 MeDIP 技术相似,该技术也是可以发现基因组中高度甲基化的区域,不能从单个碱基水平分析甲基化。


    10)基于探针的靶向富集技术 

    甲基化测序靶向富集技术采用合成寡核苷酸探针来捕获 CpG 岛、基因启动子区域以及其他一些显著性甲基化的区域。目前,市面上已有这种商品化的试剂盒。


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