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    【RNAi与siRNA技术】基因敲除鼠的实验建议

    发布时间: 2021-08-27  点击次数: 661次

    如果是在做动物实验,而且是基因敲除鼠的实验,那么就会做大批量的小鼠基因型鉴定试验,来确定自己小鼠的基因型,然而,再做实验的过程中往往会出现一些意想不到的结果,在这里为大家提一点点小建议。


    提取 DNA 

    1、组织提取 DNA 剪下老鼠 0.5-1.2cm 尾巴或者耳朵或者称取 20mg 组织样本,将样本剪碎放在 1.5ml 的 EP 管中。

    2、在每个 EP 管中加入 275 微升的裂解液(我们实验室使用的是 promega 的试剂盒)将加入裂解液的组织放在 55 摄氏度的水浴箱中过夜(16—18h)裂解完全的标志是组织完全溶解。

    3、第二天振荡每一个 EP 管,混匀后再离心,转速 13000rmp 时间是 3 分钟,取上清分离毛发,将取的上清加到柱型管中(有滤网的小柱型管,柱型管套装在 1.5 的 EP 管中)。 

    4、在每个柱型管中加入 250 微升的 Wizard SV lysis Buffer,此裂解液需要提前水浴 30min, 55 摄氏度。 

    5、离心 3min 转速 13000rpm ,倒掉滤液。 

    6、在每个管中加入 650 微升 wash solution 离心 1min 转速 13000rpm,这一步骤重复四遍,每一次都弃去管底的废液。 7、4 次洗完之后,什么都不加再离心一次,1min 转速 13000rmp。 

    8、离心之后取出,放入到新的 EP 管中,每一个 EP 管中加入 50 微升 Nuclease-free-water(无核酸酶水)需要提前水浴 30min 中 55 摄氏度。加的过程中要充分覆盖管底,静置 2min,离心 2min,保留 EP 管中的液体,此步骤重复两次。(如果要搁置需要保存在-20 冰箱中)。


    自此 DNA 已经提取完成。


    显影 

    1、将获得的液体加入 PCR 混合液中,凝胶电泳,鉴定基因型。 PCR 混合液的配制方法 ddH2O 9.5 微升,Taq12.5 微升,上游引物 0.5 微升,下游引物 0.5 微升。每一个 EP 管中的总量是 24 微升,提取的 DNA 只加 1 微升。 

    2、PCR 扩增:将样品放入 PCR 仪扩增。 

    3、制胶——1%的胶。 

    小胶:琼脂糖 0.25g+25mlTEB1% 

    中胶:琼脂糖 0.5g+50mlTEB1% 

    大胶:琼脂糖 1g+100mlTEB1%

    4、将琼脂糖加入 TEB 溶液后微波炉加热 3min,冷却后加入核酸染料 EBC,倒入制胶器制胶,30min 后取出胶放入电泳槽中,黑线朝向正极。 

    5、加样,加 Maker。 

    6、电泳。 

    7、显影。


    一些经验

    1、提取 DNA 的第一步中建议用小鼠的尾巴,优选小鼠尾巴,减轻动物疼痛且便于操作,在标记过程中每一个 EP 管要标号无论盖子顶部还是管壁,都要做标记,因为要在水浴箱中进行裂解。 

    2、在配裂解液的过程中,一般要多配出 2 份的量,因为在加样的过程中会有液体遗失,以防万一试剂缺如多配制 2 份。 

    3、在制备 pcr 混合液的时候无论是上游还是下游引物总量都不能过多,否则显影的时候会出现引物二聚体,出现重影。 

    4、加入核酸染料的量是 3 到 5 微升。 

    5、加入的 maker 和样品的量建议是 5 微升。 

    6、电泳的电压建议 100v,时间是 45min。 

    7、使用离心机的时候要注意用常温的离心机,非 4 度,因为无论是裂解液还是无核酸酶水都是经过水浴箱 55 度温浴过的,所以,用常温的离心机即可。


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