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    新型RNAi载体——saiRNA,更为安全的高效RNA干扰载体!

    发布时间: 2021-08-27  点击次数: 410次

    RNAi 技术的前世今生 

    造物真的很神奇。生物体有很多机会被来自病毒、细菌等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内。但宿主会说,“你有张良计我有过墙梯",这个过墙梯就是 RNAi:宿主细胞会对这些外源性基因 dsRNA 随即产生反应,被核酸内切酶 Dicer 切割成小片段 RNA(即 siRNA)。siRNA 再与体内一些酶结合形成 RNA 诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)。RISC 与外源性基因表达的 mRNA 进行特异性结合并将其切割,使得 mRNA 降解。然后 siRNA 还会“乘胜追击",可作为引物与靶 RNA 结合并在 RNA 聚合酶作用下合成更多新的 dsRNA, 新合成的 dsRNA 再由 Dicer 切割产生大量的次级 siRNA,从而使 RNAi 的作用进一步放大,最终将靶 mRNA 完全降解。


    新型RNAi载体——saiRNA,更为安全的高效RNA干扰载体!

    在 RNAi 感染过程中,产生 dsRNA 的一个有效方法就是在体内表达一个短发夹 RNA 分子,这种 shRNA 包含两个短反向重复序列(其中一个与目的基因互补),中间由一个 loop 序列分隔,组成发夹结构。在体内 shRNA 可以被加工 siRNA。


    传统 shRNA 脱靶作用大且抑制 miRNA

    大家都知道,利用生物体的 RNAi 现象发展出来的 RNAi 技术是目前最“喜闻乐见"的基因沉默技术。

    在科研中制备 siRNA 的方法主要有化学合成法和转录法。其中,转录法,通俗点说就是“借腹生子"。就是通过 DNA 载体,利用细胞内源的 RNA 聚合酶Ⅲ(RNA PolⅢ),如 U6、H1 等 的启动子驱动转录表达 shRNA,转录产生的发夹状 shRNA 可以被细胞内源的 Dicer 蛋白识别并加工成 siRNA,然后与 Ago 蛋白结合发挥作用。将这些 shRNA 的表达框用质粒或者腺病毒等包装一下转入宿主体内,就可以实现在动物整体或特定组织中沉默靶基因。

    虽然这项技术可以实现在动物整体或特定组织中沉默靶基因,但是不可避免的是在这个过程中 siRNA 会“乱来",比如,偶尔会饥不择食,慌不择路地与非特异的 RNA 序列结合,把人家该正常表达的“无辜"基因沉默掉,这就是所谓的脱靶作用(off-target)。

    作为 siRNA 的前身 shRNA 也会瞎捣弄,就是对细胞内源 miRNA 的竞争抑制。由于 shRNA 的加工需要细胞内的 Dicer、Exportin-5、Ago 等蛋白质因子协助,而这些万人迷般的蛋白质因子也是细胞内源 miRNA 加工成熟所必须的。由于 miRNA 是细胞功能的重要调控分子,过表达的 shRNA 与内源 miRNA 竞争相同的加工机器,必然对内源 miRNA 的表达和功能造成抑制作用。shRNA 瞎捣弄的后果可以很严重,比如在小鼠肝脏中长期高表达 shRNA 会造成严重的肝脏损伤并引发肝癌导致动物死亡。

    因此,设计一种低毒副作用的 RNAi 载体进行高效沉默靶基因很重要。


    saiRNA 的优越性:高效率、低脱靶 

    而吴立刚研究组对具有不同茎环结构的 siRNA 前体的加工和功能进行了深入研究,并在此基础上发明了一种比传统 shRNA 效率更高,脱靶作用更少的新型 RNAi 载体--saiRNA(singlestrandedAgo2-processed interfering RNA)。 在 RNAi 发挥基因沉默功能的过程中,RISC 复合物是核心成分,主要由外源提供的 siRNA 与 细胞内的 Ago 家族蛋白质组装形成。哺乳动物中其蛋白家族有四成员:Ago1、2、3、4,但 只有 Ago2 是 RNAi 的“真爱",具有 RNAi 活性(切割完全互补配对 RNA 的核酸内切酶活性), 而 Ago1、3、4 没有 RNAi 活性却会引起较强的脱靶作用。传统 shRNA 产生的 siRNA“很博爱", 能与所有 Ago 蛋白结合不同, 但吴立刚研究组发明的 saiRNA 只有与 Ago2 结合后才能被加工产生成熟的 siRNA,因此有效避免了与 Ago1、3、4 介导的脱靶作用,从而显著增强了其对靶基因的沉默效率。

    新型RNAi载体——saiRNA,更为安全的高效RNA干扰载体!

    saiRNA 的“专一"还体现在:与 Ago2 结合后加工产生成熟的 siRNA,其特殊的加工方式只产生一条导向链(guide strand,具有基因沉默功能的 siRNA 链),不会产生 passenger strand(与 guide strand 互补配对的没有基因沉默功能的 siRNA 链),因此也就完全避免了由 passenger  strand 与 Ago 蛋白结合后产生的脱靶作用。

    saiRNA 的优势还在于对细胞内源 miRNA 的影响小。这个逻辑有点绕,就是,不论是化学合成的 saiRNA,还是基于 RNA 聚合酶 III 的 DNA 表达载体在细胞内转录生成的 saiRNA,因为 对 Ago2 的专一,其被加工后产生的 siRNA 的单位浓度分子对靶基因的抑制效率都高于传统的 shRNA。因此,在同样的沉默效率下,saiRNA 产生的成熟 siRNA 在细胞内的积累量要远低于 shRNA,避免了占用大量 Ago 蛋白,并且其加工不需要 Dicer 等 miRNA 加工所必须的“万人迷"蛋白质因子,因此不会跟细胞内源 miRNA 争抢,更不会对内源 miRNA 的表达和功能造成抑制作用。

    所以,saiRNA 作为一种新型的 RNAi 载体,具有高效和低脱靶的特点,通过对 saiRNA 设计的继续优化,以及动物整体的基因沉默实验,将为科学研究和基因治疗应用提供更为安全高效的工具。



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