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    RNA转录的实验方法选择和步骤

    发布时间: 2021-08-27  点击次数: 478次

    正规化管理的实验室都会给新人进行相关技能体系的培训,但是被老板散养的研究僧或者无奈从 0 开始做科研的临床医生也不在少数。他们在初始接触分子实验时,手持《现代分子生物学实验指导》这本宝典,很容易被五花缭乱的实验方法乱了阵脚······

    连转录和反转录都不太搞得清楚的科研新人如何根据自己的实际情况各取所需呢?首先,明确自己的定位,你目前要解决的是单个问题而不是一口吃成一个大胖子,然后关键是明确实验对象和实验目的。 

    举个栗子,现在手头上的样本是某个类型肿瘤临床患者切除的组织,目的是检测这些样本与正常组织样本中几个“明星分子(如 P53 等与癌症密切相关的分子)"是不是有差异表达,该怎么做?


    1.明确自己最后一步实验是什么 

    根据实验目的,最后一步的实验其实已经确定了,就是从分子层面比较不同样本中几个基因的表达,但是分子层面可以是 RNA 转录水平,也可以是蛋白质表达水平。作为新人,自然选择前者,因为经打听和查资料后我发现,RNA 转录使用实时荧光定量 PCR(qPCR)方法就好,容易上手出结果快,而对比蛋白质表达水平的 Western Blot(WB),在抗体成本和摸索实验体系的时间成本上都不合算(当然,很多实验中如果 RNA 转录水平出现差异,还是很有必要在蛋白水平进行验证的)。 

    所谓 qPCR 技术,是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术实现了 PCR 从定性到定量的飞跃,它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具。


    2.找出所有涉及到的分子实验 

    从最后一步实验往前推,qPCR 需要哪些基本的元素?具体如下: 

    *qPCR 的模板→当然不能直接用肿瘤组织和正常组织→查资料发现模板是 cDNA→怎么制备 cDNA?→提取所有组织样本的 RNA 进行反转录(逆转录-聚合酶链式反应,RT-PCR)→我需要 RNA 抽提试剂盒和反转录试剂盒→完成 RNA 的提取和 cDNA 的合成(放心,试剂盒里都会有非常具体的操作说明书,但是自己要多查资料了解原理,不然你和流水线操作员何异?) 

    *qPCR 的引物→根据已经确定的分子自己使用引物设计软件设计或者查找文献找到经过验证的引物,不要忘了 GAPDH 或者其他内参的引物 

    *SYBR® GREEN→商业试剂盒 

    *酶→包含在 SYBR® GREEN 试剂盒中 

    *RNase-free H2O→一般在 SYBR® GREEN 中会有对应的 H2O,小伙伴们千万不要使用正常 PCR 中使用的高温灭菌 H2O,否则溶解曲线让你分分钟想撞墙。


    3.Just do it 

    根据 SYBR® GREEN 试剂盒说明书中的体系要求完成实验操作(冰上操作)和对 qPCR 仪器的设置,具体仪器的使用方法一定要多多问别人。

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