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    【技术】提升蛋白质样品质量,三招就足够!

    发布时间: 2021-09-03  点击次数: 229次

    在制备中丢失的蛋白质是永远不可能在后面的实验中弥补回来的。蛋白质样品制备是许多实验重要的第一步。为什么要进行样品的制备?电泳的目的不就是分离吗?刚刚接触时有这样的疑问。然并卵,由于双向电泳一般只能分辨到 1000-3000 个蛋白质点,而样品蛋白质的种类可是高达 10 万种以上,因此样品的预分离制备是必须的。下面就来讲讲分离制备蛋白样品时,你必须知道的那三件事。

    1. 选对酶抑制剂,避免蛋白质降解 

    牢记最小限度的减少蛋白水解和其它形式的蛋白降解是制备样品的第一步,这一步看似简单,但是操作中一旦方法不当,就有可能会丢失样品中的蛋白和导致蛋白被修饰。 

    大家可能都知道在提取蛋白质时要添加蛋白酶抑制剂抑制蛋白酶降解。但是有人可能会说,我明明加了 PMSF,怎么曝光出来的条带和内参效果几乎一样啊,然而 PMSF 并不是万能的,你的目的蛋白是磷酸化的还是非磷酸化的呢?如果是磷酸化的蛋白,那么你就得换一个酶抑制剂了,罗氏的Cooktail对磷酸化的目标蛋白效果不错;为了减少温度对蛋白质的影响,一定不能忘记低温操作!

    2. 富集蛋白有妙招 

    只要你的实验室有一台转速可以超过 12000r/min 的离心机,那么就可以选用简单绿色的蛋白质富集方法:超速离心法。一般它能满足你 WB 所需蛋白的要求。常用的蛋白质富集和纯化方法是用丙酮、TCA、乙醇、异丙醇、氯仿/甲醇、硫酸铵、聚乙烯乙二醇(PEG)或亲和层析试剂盒。然而当你需要 HPLC-MS 的蛋白样品时,2D-PAGE 电泳能够将不同分子量和等电点的蛋白质分离,那么你的质谱图就再也不会只是一坨黑了!

    3. 去除杂质步骤不可少 

    为什么我的质谱图杂带比主带还多,主峰去哪儿了,找不到!曝光出来的条带像一张过敏脸,乱七八糟的!实验中处理用的缓冲液、盐、清洁剂等都会影响蛋白质分离,显色等步骤,还会干扰质谱分析,影响条带灰度值的计算,所以去除缓冲液、盐和清洁剂类杂质显得尤为重要。去除盐类经常是通过透析、超滤、胶过滤、TCA 沉淀或者有机溶剂和固相萃取等;样品中广谱的清洁剂,离子交换层析可有效地去除非离子和两性清洁剂;类似于盐类,脂质广泛存在于生物的体液中。许多蛋白质会结合脂质,从而降低溶解性,甚至影响等电点和分子量。丙酮沉淀或结合 TCA/丙酮可以有效去除脂质;多聚糖和核酸可能和两性电解质反应,造成双向电泳胶上纹理的出现、使胶的背景产生拖尾和堵塞聚丙烯酰胺胶上的小孔。用 TCA、丙酮 苯或酚/醋酸铵沉淀后离心从样品中除去多聚糖是还是很有效的。

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