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    认识蛋白质组学鉴定技术

    发布时间: 2021-09-06  点击次数: 953次

    在蛋白质组学研究流程中,蛋白质鉴定技术是最关键的部分。在蛋白质组分离技术方面还有凝胶电泳技术和色谱技术的选择,而蛋白质鉴定技术方面却只是生物质谱技术(BioMass Spectrometry)一枝独苗。质谱技术在二十世纪初就已出现,但一直仅应用于有机小分子领域,直到八十年代才渐渐应用到生物大分子领域。经过二十多年来的应用和发展,质谱技术已是蛋白质组研究中不可少的工具,并成为蛋白质组研究中的主要支撑技术。

    质谱技术的基本原理是使样品分子离子化后,根据不同离子间的质荷比(m/z)的差异来分离并确定相对分子质量。一台质谱仪一般有进样装置、离子化源、质量分析器、离子检测器和数据分析系统组成。在这几部分中,离子化源和质量分析器是两个核心部件,也是发展得最快的两个方面。根据离子化源的不同,质谱主要可以分为电喷雾电离质谱(Electrospray  Ionization Mass Spectrometry,ESI-MS)和基质辅助激光解析电离质谱(Matrix Assisted Laser  Desorption Ionization Mass Spectrometry,MALDI-MS)两大类。


    电喷雾电离质谱

    所谓电喷雾电离质谱就是以电喷雾离子化(ElectroSpray Ionization,ESI)为电离方式的质谱。电喷雾离子化是一种“软电离"方式,它是在“离子蒸发"原理上发展起来的一种离子化方法。离子蒸发是指离子从液相发射到气相的过程。待测分子溶解在溶剂中,以液相方式通过毛细管到达喷口。在喷口高电压作用下形成带电荷的微滴,随着微滴中的挥发性溶剂蒸发, 微滴表面的电场随半径减少而增加,到达某一临界点时,样品将以离子方式从液滴表面蒸发,进入气相。这一过程即实现了样品的离子化,没有直接的外界能量作用于分子,因此对分子结构破坏较少,是一种典型的“软电离"方式。

    电喷雾质谱的另一大特点是可形成多电荷离子,因此在较小的 m/z 范围内可以检测到大分子质量的分子。采用电喷雾质谱目前可测定分子质量 100 kDa 以下的蛋白质,最高可达 150 kDa。由于离子蒸发使电喷雾质谱采用液相方式进样,因此可与蛋白质化学中常用的液相色谱联用,即液相色谱-电喷雾质谱(LC-ESI MS),蛋白质或多肽经过高效液相色谱分离后,直接进入质谱进行分子质量测定。

    在常规电喷雾质谱中,喷雾的过程易形成较大液滴,液滴中的样品分子在离子源就不能完全离子化,从而降低了样品的利用率和灵敏度。近年发展的纳升电喷雾技术 (nanosprayESI,nano-ESI)有效的解决了这一问题,使样品被充分利用,并有效离子化。


    基质辅助激光解析电离质谱

    基质辅助激光解析电离质谱(MALDI-MS)是利用固体基质分子均匀的包埋样品分子,在激光的照射下,基质分子吸收激光能量而蒸发,携带样品分子进入气相,进一步将能量传递给样品分子,从而实现样品分子离子化。由于样品的电离过程是由基质介导的,因此基质的选择对分子离子化有很大的影响, 继而影响到分析的灵敏度、分辨率和精确度。合适的基质应该是保证待测物的离子化,而且基质本身的离子造成的背景较弱。蛋白质和多肽样品较为通用的基质有芥子酸(Sinapinic Acid,SA)、a-氰基-4-羟基肉桂酸(a-cyano-4-hydroxycinnamic acid,CHCA) 和 2,5-二羟基苯甲酸( 2, 5-dihydroxybenzoic acid,DHB)。MALDI 最大的特点是 离子电荷通常为 1-2 个,而不象 ESI 中为多电荷离子,对分子质量较大的样品而言,不会形 成复杂的多电荷图谱,因而对图谱的解析比较清楚。


    串联质谱

    串联质谱在解析蛋白质或者肽段序列信息以及蛋白质磷酸化位点等方面具有无法替代的作用,这里专门予以介绍。 

    串联质谱(tandem MS,MS/MS)是指多个质量分析器相连,分离母离子,进行碰撞解离,并检测子离子。MS/MS 较早在四极杆质谱中实现:将三个四极杆串联,第一个四极杆进行母离子分析,选择感兴趣的离子进入第二个四极杆,与惰性气体碰撞成碎片后,进入第三个四极杆进行子离子分析。

    与串联质谱平行的一个概念是碰撞诱导解离(Collision Induced Dissociation,CID)。在串联质谱诞生以前,为获得分子结构信息,需要在离子源内(in-source)对离子进行碰撞,使其碎裂。源内 CID 灵敏度高,但没有选择性,因此碎片的专一性不强。串联质谱出现后,逐渐取代了源内 CID。严格地说,CID 仅指离子解离成碎片的过程,串联质谱则包括了母离子 选择、CID 和子离子分析三个过程。


    质谱技术新进展

    最新发展应当是 2005 年由热电公司推出的静电场轨道阱(Orbitrap)质谱,是 20 年来离子阱质谱技术的重大突破。Orbitrap 是一种离子阱,但是它不同于传统的离子阱,它既没有射频电场也没有磁体产生的磁场来捕获离子。进入 Orbitrap 的离子是由里面的静电场来捕获的。该质谱仪的质量分辨率可以和离子回旋共振质谱相媲美,为小分子研究、药物开发、 蛋白质组学、代谢物鉴定等提供了更出众的性能,而且体积较小,价格相对便宜。

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