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    【蛋白技术】蛋白标签TAG是什么高大上的东西?

    发布时间: 2021-09-03  点击次数: 1062次

    首先,蛋白标签(proteintag)是什么? 

    蛋白标签(proteintag)是指利用 DNA 体外重组技术,与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白,以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。 

    蛋白标签大体可分为三大类:遗传标签、in vivo 标签和 in vitro 标签。大家最熟悉的莫过于遗传标签,即 c-Myc、FLAG 等:将目的基因克隆到含有标签的载体上,以便下游通过抗体或荧光检测。同时,标签的存在也方便了蛋白纯化。


    下面就介绍几款常用的 tag 给大家扫扫盲:

    名声在外的 Flag-tag: 

    Flag 标签蛋白为编码 8 个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK),同时载体中构建的 Kozak 序列使得带有 FLAG 的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。

    优点: 

    FLAG 作为融合表达标签,其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质; 

    融合 FLAG 的目的蛋白,可以直接通过 FLAG 进行亲和层析,此层析为非变性纯化,可以纯化有活性的融合蛋白,并且纯化效率高; 

    FLAG 作为标签蛋白,其可以被抗 FLAG 的抗体识别,这样就方便通过 Western Blot、ELISA 等方法对含有 FLAG 的融合蛋白进行检测、鉴定。

    融合在 N 端的 FLAG,其可以被肠激酶切除(DDDK),从而得到特异的目的蛋白。因此现 FLAG 标签已广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。


    平易近人的 His6-tag: 

    His6 是指六个组氨酸残基组成的融合标签,可插入在目的蛋白的 C 末端或 N 末端。当某一个标签的使用,一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成*的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力,可用于固定化金属螯合层析(IMAC), 对重组蛋白进行分离纯化。 

    优点: 

    标签的分子量小,只有~0.84KD,一般不影响目标蛋白的功能; 

    His 标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化; 

    His 标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA 相互作用研究; 

    His 标签免疫原性相对较低,可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫制备抗体; 

    可应用于多种表达系统,纯化的条件温和;可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。


    高大上的 GST-tag: 

    GST(谷胱甘肽巯基转移酶) 标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶,它的天然大小为 26KD。

    将它应用在原核表达的原因大致有两个: 

    一个是因为它是一个高度可溶的蛋白,希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性; 

    另一个是它可以在大肠杆菌中大量表达,起到提高表达量的作用。

    GST 融合表达系统广泛应用于各种融合蛋白的表达,可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达。结合的融合蛋白在非变性条件下用 10mM 还原型谷胱甘肽洗脱。在大多数情况下,融合蛋白在水溶液中是可溶的,并形成二体。GST 标签可用酶学分析或免疫分析很方便的检测。标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其稳定性。在大多数情况下 GST 融合蛋白是完全或部分可溶的。

    纯化:该表达系统表达的 GST 标签蛋白可直接从细菌裂解液中利用含有还原型谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Glutathionesepharose)亲和树脂进行纯化。GST 标签蛋白可在温和、非变性条件下洗脱,因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST 在变性条件下会失去对谷胱甘肽树脂的结合能力,因此不能在纯化缓冲液中加入强变性剂如:盐酸胍或尿素等。

    如果要去除 GST 融合部分,可用位点特异性蛋白酶切除。 

    检测:可用 GST 抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。


    常规化的 c-Myc-tag 

    C-Myc 标签蛋白,是一个含 11 个氨基酸的小标签,标签序列 Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-GluGlu-Asp-Leu,这 11 个氨基酸作为抗原表位表达在不同的蛋白质框架中仍可识别其相应抗体。 C-Myc tag 已成功应用在 Western-blot 杂交技术、免疫沉淀和流式细胞计量术中, 可用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。

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