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    发高分 SCI,不会免疫组化(IHC)怎么行?

    发布时间: 2021-09-07  点击次数: 221次

    相信大家对 IHC 一定不陌生,世界那么大,实验方法层出不穷,但是免疫组化却是经典中的经典,想看看别的高大上的技术?不急,我们先来复习复习免疫组化。

    免疫组化,免疫组织化学技术(immunohistochemistry),是一项利用抗原抗体反应,通过使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原,对蛋白定位,定性的实验技术。

    免疫组化主要用的是组织标本和细胞标本两大类,组织标本包括石蜡切片(病理切片和组织芯片)和冰冻切片。石蜡切片,对组织形态保存好,保存时间也长,虽然对组织抗原暴露有影响,但可以抗原修复,所以石蜡切片仍然是首先选择的标本制作方法。

    好了,重点来了,下面是免疫组化步骤和经验,各位看官不要错过哦!

    ① 在 60°烤箱烤片 30~60min,这一步是为了使蜡片水分蒸发和石蜡融化,好让组织切片牢固贴在玻片上。做切片是免疫组化的前提切片子最好是找专业培训过的人员切片,片子的厚薄均匀,切片的完整,无褶无刀痕。考研刀工的时候。

    ② 脱蜡水化,依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各 10min,乙醇梯度(高至低)各 2min,水。然后用自来水洗一下,但不要直接对着切片冲洗。

    ③ 抗原修复,用的是高压热修复,ph6.0 的柠檬酸盐缓冲液,一定要全部浸泡切片,等高压锅冒气后 5min 结束,自然冷却,温度骤降可能引起脱片哦。3%H2O2 避光浸泡 15min (当然有的朋友用 EDTA 修复或者说使用微波修复等方法也是可以的,但是每一种抗体对不同的抗原修复方法的反应是不一样的,得具体对待。) 

    ④ 这一步有神器,用“组传"的免疫组化油笔围绕组织画圈,接下来就能看见它的功效了。 PBS 洗 5min x 3 次。PBS 会被锁在画的圈中,不会流干,保证不干片。 

    ⑤ 滴加 5%BSA (BSA 用 PBS 溶)稀释的一抗,每个组织约 20ul,用 200ul 的枪头尖的一端抹平,4°过夜或者 37°1~2h,这里用的是第二种方法。(每种组织大小不一样,面积大概 1 乘 1 的可以 20ul 就够了,对于类似 NPC 的组织就没必要这么大了,关于一抗的问题,个人建议 4°过夜的方法,当然 37°1~2hour 也是可以的,两种方法没法说谁好谁不好,不同的抗体对方法的敏感性是不一样的)再次 PBS 洗 5min x 3 次。 

    ⑥ 滴加二抗,一滴每个,用 200ul 的枪头尖的一端抹平,室温静置 30min。(货号 GK500705 的二抗检测试剂盒,很好用,极力推荐。)

    ⑦ 再次 PBS 洗 5min x 3 次

    ⑧ DAB- H2O2 显色 10min。(B:C=1:50,25ul 每个,现配现用),在这时要观察,如果染色明显,不到 10 分钟即可蒸馏水洗终止显色,但是一般超过 20min 都不会有什么好结果。 

    ⑨ Mayer 苏木素染色 30s,水洗,盐酸酒精分化 3s,流水浸 15min 

    ⑩ 脱水,乙酸 2min,乙醇梯度(低至高)各 2min,二甲苯 5min 

    ⑪ 中性树胶封片。


    结果分析:

    镜下细胞核呈蓝色,阳性结果呈深浅不一的棕色

    结果分析主要有两种方法,阳性着色细胞计数法和评分法。前者是在 40*光镜下,随机 10 个视野下计数阳性着色细胞;后者则是在光学显微镜下按染色程度(0 分阴性着色,1 分 淡黄色,2 分浅褐色,3 分深褐色)和阳性范围(1 分 0-25%,2 分 26-50%,3 分 51-75%,4 分 76-100%)评分,最终分数相加。


    再来看下反面教材 

    较为常见的非特异性着色;还有背景过深的。要避免成为上述的两种典型,做出一张可以见老板的结果,每步都要且做且思考。


    啰嗦几句:

    1、脱蜡和脱水的步骤呢,每个实验室都有自己独到的方法,用的乙醇的梯度不完全相同,大家按照自己的习惯那套来就好。但要注意,脱蜡和水化不全引起局灶性反应,会导致非特异性着色。 

    2、一定要防止干片!干片也很容易引起非特异性着色。 

    3、在用枪头抹平抗体时,要尽量将枪头放平,用斜面而不要用尖头接触组织,这一步要轻柔小心,可能你只是轻轻刮到几下,但镜下组织就变得乱七八糟的了(别问我是怎么知道的) 

    4、PBS 在洗的时候,不要对着组织冲洗,会脱片。小编的方法是将冲洗着力点放在玻片的边缘,让液体自然流向组织。 

    5、一抗浓度至关重要,这直接影响了最终的结果,摸条件时设置一抗浓度梯度。建议同时设置一个阳性对照,可以排除一抗之外的操作问题。 

    6、背景染色过深的话,就要考虑一抗浓度过高或者一抗时间过长,显色时间过长这些问题了。

    7、降低组织非特异性染色,可以缩短一抗,二抗的时间,稀释抗体,也可以增加几次 PBS 冲洗。或者直接用单抗。


    免疫组化往往作为检测某蛋白在组织的表达情况出现在预实验中,免疫组化的结果可能将直接影响课题的后续设计和进展。如果说我们的科研课题是一个大世界的话,免疫组化是我们看向这个世界的敲门砖。做好免疫组化,我们一起去更大的世界看看!

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