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    如何避免掉进做免疫组化时导致非特异性染色的八大坑?

    发布时间: 2021-09-08  点击次数: 302次

    全国江山一片红,这可不是阅兵日的朋友圈,而是在做免疫组化啊!好好的一张片子染得脏脏的。一下子整个人都不好了。这里,总结出了导致非特异性染色的八个大坑,以及避免掉坑里的一些做法。皆是独门绝技,不要眨眼咯!


    1、抗体问题,真的是一分钱一分货

    一抗用多克隆抗体容易出现非特异性染色,建议用高纯度,高效价的针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。单克隆抗体很贵,不过结果真的很好。尤其是背景非特异性染色不会太深。真是一分价钱一分货。一抗过期也会造成杯具,所以要注意抗体的有效期。


    2、抗体浓度过高/孵育时间过长 

    一抗浓度太高也是出现非特异性染色的常见原因。解决的办法就是预实验。每次使用新抗体前应该多做预实验,摸索出较为理想的工作浓度,不能简单地按照说明书来用。另一个常见原因就是孵育时间过长。解决的办法就是定时器。加上抗体后,立刻调好定时器,提醒自己及时终止反应,就会避免这个问题。


    3、DAB 染色时间太长/变质 

    DAB 的孵育时间过长,会造成背景非特异性染色。DAB 的显色时间不是一成不变的,主要靠自己在显微镜下盯着,一旦出现浅浅的棕色的时候,就要马上冲洗。出现棕色的时间过短,表明抗体浓度过高;出现棕色的时间过长,表明抗体浓度过低。DAB 要保存于避光干燥的地方,现用现配,临用前才加入 H2O2。图 1 就冲洗的有些晚了;图 2 就是刚刚好,染色效果棒棒哒!


    如何避免掉进做免疫组化时导致非特异性染色的八大坑?


    4、内源性酶和生物素 

    内源性酶和生物素也会造成非特异性染色,特别是一些内源性酶生物素含量丰富的组织,如肝脏,肾脏,脾脏等。处理的办法为:灭活碱性磷酸酶:较为常用的方法是将左旋咪唑(24 mg/mL) 加入底物液中,并保持 PH 值在 7.6-8.2,即能除去大部分内源性碱性磷酸酶;对于酸性磷酸酶,可以用 50 mmol/L 的酒石酸抑制;对于内源性过氧化物酶,可以用 0.9%的双氧水来灭活。对于内源性生物素,染色前将切片浸于 25 μg/mL 亲和素溶液中 15 分钟,PBS 清洗 15 分钟后即可染色。也可以 24 mg/mL 的卵白素封片 15 分钟。


    5、组织变干 

    一下子染太多片子的时候,容易出现这种情况。解决的办法就是不要贪多嚼不烂。一次少染几张。还有就是试剂充分覆盖组织,超出组织边缘 2 mm。然后用 PAP 笔在组织周围画一个圈圈,把修复液圈在里面。避免修复液流走。圈圈应该距离组织边缘 3-4 mm。


    如何避免掉进做免疫组化时导致非特异性染色的八大坑?


    6、浸泡时间过长 

    切片在缓冲液或修复液里面浸泡过夜,也会引起杯具。这都是偷懒的做法。但是有时候也是可以偷一下懒的。独门秘技就是 4°C 冰箱。只要把容器放在 4°C 冰箱里,过夜完全没有问题。


    7、清洗不充分 

    清洗一定要充分。PBS 液一定要双蒸水新配,用之前再次测 PH 值。缓冲液用 0.05 mol/L 的 Tris-HCL,0.15 mol/L 的 NaCl 即可。如果加一点去垢剂 Tween-20 就更好了。


    8、封闭血清问题 

    是否选择了正确的封闭血清。原则是选择二抗动物的非免疫血清,例如二抗是羊抗兔,就要选择非免疫羊血清。用 PBS 稀释为 3-10%的溶液孵育切片,37°C 10-30 分钟。这里不用洗,直接甩掉即可。再贡献一个独门绝招,直接用奶粉也可以。用 5%的脱脂奶粉就可以了。而且效果还不错。怎么样?简单吧。 


    免疫组织化学是个苦活脏活。步骤多,时间长,还要接触有毒有害的物质。要是好好的一张 片子染出来都是全国江山一片红,那才叫亏大发了。以上,介绍了一些心得体会,希望对大家有所帮助。

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