CO-IP没有条带的常见原因和解决的办法

CO-IP 并不容易做，尤其是两个蛋白丰度低，相互作用力较弱的时候。做 CO-IP 经常会遇到没有条带的问题。这里谈谈 CO-IP 没有条带的常见原因和解决的办法，更有独门配方献上。

蛋白浓度过稀 

绝大多数情况下，CO-IP 没有条带是由于蛋白浓度过稀。裂解产物的蛋白浓度越高越好。但是，有些实验室喜欢稀释裂解样品的蛋白浓度再做 CO-IP。其实，在大多数情况下要尽可能避免稀释你的细胞裂解液。尽量使细胞裂解产物的蛋白浓度可达 7-8 mg/ml 左右。这才会避免发生没有条带的情况。

没有裂解开 

很多时候，由于裂解液不够强烈，蛋白质复合物没有分开，也会造成没有条带的问题。解决办法是：加温和加少量的 SDS 增加变性能力。这里再介绍一个小窍门：最初几遍的漂洗 buffer 要和 IP 时的盐浓度相同。纯化蛋白的时候，如果用低盐裂解细胞，高盐漂洗去杂质，蛋白丢失较多。再奉献一个独门配方：20 mM Tris/HCl，pH7.6，100 mM  NaCl，20 mM KCl，1.5 mM MgCl2，0.5% NP-40 and protease inhibitors （0.5M PMSF）。包用包好。

量不合适

很多时候，CO-IP 没有条带，是由于蛋白量，珠子，抗体的量需要调整。根据经验，一般 100ug 蛋白，3ug 抗体，30ug 珠子。如果不行，250ug 蛋白，5ug 抗体，或者 500ug 蛋白，7ug 抗体。

抗体太坑

抗体是 CO-IP 成败的致命因素之一！必须是 IP 级别的抗体。说句不好听的话，不要用国产抗体和 Santa Cruz 的抗体。这些抗体在做 CO-IP 的实验室里面已经臭名远扬了。坑人无数。大家就不要再重蹈覆辙了。 

单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。两种抗体各有利弊。单抗特异性强，背景低。但是单抗有一个致命的弱点，就是识别位点单一，而在 CO-IP 过程中，该位点很有可能与其它蛋白或核酸结合而被封闭，导致单抗不能识别靶蛋白而没有条带。所以，如果没有十足把握，单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域，还是选择多抗比较稳妥一些。至少不会出现没有条带的问题。

细胞数量太少 

很多时候，CO-IP 没有信号是由于细胞数量太少。一般是 145 mm 的培养皿，至少要长到 50%以上。如果低于这个数目，CO-IP 就很有可能没有信号。除非药品和试剂非常非常昂贵，否则就不要节约这点细胞了。一旦 CO-IP 实验失败，浪费的时间可是更宝贵的。

综上所述，CO-IP 是比较难做的一个实验。很多时候，能否成功取决于抗体和两个蛋白的结合常数，和 protocol 和实验操作本身的关系不大。以上，介绍了一些经验体会和小技巧小窍门，希望对大家有所帮助。