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    CO-IP没有条带的常见原因和解决的办法

    发布时间: 2021-09-13  点击次数: 893次

    CO-IP 并不容易做,尤其是两个蛋白丰度低,相互作用力较弱的时候。做 CO-IP 经常会遇到没有条带的问题。这里谈谈 CO-IP 没有条带的常见原因和解决的办法,更有独门配方献上。


    蛋白浓度过稀 

    绝大多数情况下,CO-IP 没有条带是由于蛋白浓度过稀。裂解产物的蛋白浓度越高越好。但是,有些实验室喜欢稀释裂解样品的蛋白浓度再做 CO-IP。其实,在大多数情况下要尽可能避免稀释你的细胞裂解液。尽量使细胞裂解产物的蛋白浓度可达 7-8 mg/ml 左右。这才会避免发生没有条带的情况。


    没有裂解开 

    很多时候,由于裂解液不够强烈,蛋白质复合物没有分开,也会造成没有条带的问题。解决办法是:加温和加少量的 SDS 增加变性能力。这里再介绍一个小窍门:最初几遍的漂洗 buffer 要和 IP 时的盐浓度相同。纯化蛋白的时候,如果用低盐裂解细胞,高盐漂洗去杂质,蛋白丢失较多。再奉献一个独门配方:20 mM Tris/HCl,pH7.6,100 mM  NaCl,20 mM KCl,1.5 mM MgCl2,0.5% NP-40 and protease inhibitors (0.5M PMSF)。包用包好。


    量不合适

    很多时候,CO-IP 没有条带,是由于蛋白量,珠子,抗体的量需要调整。根据经验,一般 100ug 蛋白,3ug 抗体,30ug 珠子。如果不行,250ug 蛋白,5ug 抗体,或者 500ug 蛋白,7ug 抗体。


    抗体太坑

    抗体是 CO-IP 成败的致命因素之一!必须是 IP 级别的抗体。说句不好听的话,不要用国产抗体和 Santa Cruz 的抗体。这些抗体在做 CO-IP 的实验室里面已经臭名远扬了。坑人无数。大家就不要再重蹈覆辙了。 

    单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。两种抗体各有利弊。单抗特异性强,背景低。但是单抗有一个致命的弱点,就是识别位点单一,而在 CO-IP 过程中,该位点很有可能与其它蛋白或核酸结合而被封闭,导致单抗不能识别靶蛋白而没有条带。所以,如果没有十足把握,单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域,还是选择多抗比较稳妥一些。至少不会出现没有条带的问题。


    细胞数量太少 

    很多时候,CO-IP 没有信号是由于细胞数量太少。一般是 145 mm 的培养皿,至少要长到 50%以上。如果低于这个数目,CO-IP 就很有可能没有信号。除非药品和试剂非常非常昂贵,否则就不要节约这点细胞了。一旦 CO-IP 实验失败,浪费的时间可是更宝贵的。


    综上所述,CO-IP 是比较难做的一个实验。很多时候,能否成功取决于抗体和两个蛋白的结合常数,和 protocol 和实验操作本身的关系不大。以上,介绍了一些经验体会和小技巧小窍门,希望对大家有所帮助。


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