三天征服Chip的经验分享

在科研界，CHIP 无疑是高冷的女神，在追逐的过程总是分分钟虐得体无完肤，糟心的实验结果更是分分钟想去“狗带"。征服 CHIP 的路上，有多虐心就有多少要注意的地方。庆幸的是，曾得到女神青睐的前辈们积累了不少经验。好的经验要分享，特地总结了各位高手们做 CHIP 的经验，在此奉上，希望能助大家一臂之力。

染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation，CHIP）是目前研究体内 DNA 与蛋白质相互作用的*方法，能够比较真实的反应细胞内转录因子 TF 与启动子 Promoter 的结合情况。其基本原理：在活细胞状态下，把胞内 DNA 与蛋白质交联成复合物，通过超声或酶处理将染色质随机切断为一定长度范围内的小片段，然后利用抗原抗体特异性识别反应，将与目的蛋白结合的 DNA 沉淀下来，特异性富集目的蛋白结合 DNA 片段，进而对目的片断进行纯化与检测（如 qPCR、基因芯片、测序等），从而获得蛋白质与 DNA 相互作用的信息。

CHIP 主要分为两种：交联染色质免疫沉淀（Cross-linkedChip，XChip）和自然染色质免疫沉淀（Native Chromatin Immunoprecipitation, NChip）。两者的区别在于 XCHIP 需要甲醛固定，适合于结合力较弱的 DNA-蛋白质相互作用的研究；而 NCHIP 则不需要甲醛固定，不需要交联反应，主要用于组蛋白修饰（如组蛋白 H3 和 H4，它们本身与 DNA 结合非常紧密）、核小体定位的研究。在 NCHIP 中，DNA 结合蛋白与 DNA 之间保持一种自然状态，需要采用微球菌核酸酶对染色质进行消化。 一般而言，我们所提的染色质免疫共沉淀指的是 XCHIP。那么长话短说，将 XCHIP 三天实验中的常见流程及注意事项分享给大家。 

第一天 

细胞的甲醛交联 

1）收集细胞，加入甲醛（终浓度为 1%），37℃孵育 10min 后，加入甘氨酸（终浓度为 0.125M），混匀后在室温下放置 5min 即可。 

2）离心弃上清，收细胞于 15ml 离心管中，用 3ml 预冷的 1×PBS 洗两次后，预冷后 2000rpm  5min 收集细胞。 

3）弃上清，按照细胞量，加入 SDS Lysis Buffer，使细胞浓度为 1×106 个/100 ul。再加入蛋白酶抑制剂复合物。

Tip: 

1、细胞生长状态要好，因其生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络，可能会影响你所研究的 TF 与 Promoter 的结合。因而，一般细胞长到 75%-80%比较好。

2、交联程度会影响到超声破碎的效果，交联程度越高，超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段，背景色加深；交联不充分，则只有一部分靶蛋白与 Promoter 结合，富集得到的 Promoter 的量不高，产生实验假阴性。建议样品交联的时间为 2-30min。 

3、用 SDS 重悬细胞时，要选用小的 tip 头，在液面下吹打，否则很容易产生气泡，会对后续超声破碎带来不便。

超声破碎 

1）冰上孵育 10min 后，利用超声波或微球菌酶将染色质随机切为 200~1000bp 的小片段。 14000rpm 离心 10min（4℃），转移上清于 1.5ml EP 管中。 

2）取出 100ul 超声破碎产物，加入 4ul 5M NaCl（终浓度为 0.2M），65℃处理 4h 进行解交联，电泳检测超声破碎的效果。 

3）另取出 100ul 超声破碎产物，加入 900ul ChIP Dilution Buffer 和 20 ul 的 50× PIC，再加入 60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA，去除非特异性。4℃颠转混匀 1h 后，1000rpm 离心 3min，收集上清。

Tip: 

1、不同细胞系需不同的超声时间才能达到*效果，则可通过时间梯度的超声来选择*超声条件。

2、每份超声样品取 50ul，标记为 input，用于定量 DNA 浓度（稀释 200 倍，测 OD260）和作为 PCR 空白对照。同时超声后样品应立刻存于-70℃中，避免多次反复冻融。 

3、加入 Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA 之前一定要混匀，因为 Salmon sperm DNA 是很粘稠的物质，若不混匀，后面 beads 量不一样，对实验结果产生影响。

第二天 

免疫共沉淀

1）一管加入 1ul 抗体，另一管中则不加抗体作为对照。4℃颠转过夜。 

2）孵育过夜后，每管加入 60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA，沉淀抗体/抗原复合物， 4℃颠转 1h。1000rpm 4℃ 3min 收集沉淀，弃上清。 

Tip: 

1、每个样品都采用 25ug 的 DNA 量，同时抗体的量为 1-10ug 的抗体/25ulDNA。 

2、单抗与多抗的选择也需慎重考虑。单抗特异性强，背景低，但是识别位点单一，在 CHIP 甲醛交联过程中，很有可能该位点被其他蛋白或核酸结合而被封闭，导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没有此问题，但是特异性差，背景可能会偏高。一般建议选择多抗；选择单抗时要注意其识别位点需远离靶蛋白与核酸结合的区域。

纯化 DNA 片段 

1）依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗过程：加入溶液 1ml，在 4℃旋转 5min，1000rpm  3min，去除上清。 

洗涤液： 低盐免疫复合物洗脱液，洗一次；高盐免疫复合物洗脱液，洗一次；氯化锂免疫复合物洗脱液，洗一次； TE Buffer，洗两次。

2）清洗完毕后，进行洗脱。每管加入 250ul 洗脱液，室温下颠转 15min，1000rpm 3min，收集上清液。最终的洗脱液为每管 500ul。

洗脱液： 100ul 10% SDS，100ul 1M NaHCO3 ，800ul ddH2O ，共 1ml。 

3）解交联：每管加入 20ul 5M NaCl（终浓度为 0.2M），混匀后，65℃解交联过夜。

Tip: 

1、洗涤时，前几个步骤可以不用洗的太干净，但最后一个要尽量吸取干净，必要时可用 gel  loading tips 吸取上清液。 

2、含 beads 的样品离心时，转速不能太快，防止 beads 破碎，但如果采用的是磁性的 beads 就不存在这个问题。 

3、解交联时，建议在离心前，先把蒸发到离心管盖子上的部分离下来。

第三天 

DNA 样品的回收 

1）每管加入 1ul RNaseA（MBI），37℃孵育 1h。 

2）每管加入 10ul 0.5M EDTA，20ul 1M Tris.HCl（pH 6.5），2ul 10mg/ml 蛋白酶 K。45℃处理 2h。

3）DNA 片段回收—OMEGA 胶回收试剂盒，最终的样品溶于 100ul ddH2O

Tip: 

1、样品中 SDS 含量较高时，普通 PCR 回收试剂盒进行 DNA 片段回收时，在过柱前，可在样品中加入一定量的异丙醇，这样可有效消除 SDS 沉淀。 

2 、一个 CHIP 一般需要 3~4 天时间，其中有几个步骤是可以停下来的： 

（1）细胞收集：用含蛋白酶抑制剂的 PBS 洗涤离心，去上清的细胞收集液可置-80℃冻存； 

（2）用 SDS 重悬细胞后可置-80℃冻存； 

（3）超声破碎结束时，离心后的上清置新的离心管后可置-80℃冻存；

（4）解交联后的标本可置-80℃冻存

DNA 样品分析 

如果目的蛋白的靶序列已知，或怀疑某一序列是目的蛋白靶序列，可选用定量或者半定量 PCR 方法。如果目的蛋白的靶序列未知或要研究目的蛋白基因组分布情况，找出转录因子结合位点，则可采用 CHIP 克隆测序（CHIP-seq）、CHIP-chip 等方法。

PCR 分析 

目前检测方法主要有 3 种： 

CHIP-qPCR：用于比较沉淀的模板与阴性和阳性对照信号强度的相对精确的定量 PCR 方法。成本较低。此外，还有一些由 ChIP 衍生出来的方法，如 RIP（即用 ChIP 的方法研究细胞内 蛋白与 RNA 相互结合，具体方法和 ChIP 差不多，只是实验过程中要注意防止 RNase，最后 分析时需先将 RNA 逆转录为 cDNA）

Tip : 

1、1~10ul 的移液枪取 3ul 以上才比较准确，要考虑好自己 PCR 反应体系的配置。 

2、每次 qPCR 之前都要把 sample 离心保证取样的准确。 

CHIP-chip：Chip 和 DNA 微阵列芯片技术结合是种高通量分析 DNA 和蛋白质结合或翻译后染 色质和组蛋白修饰的方法。即将经过染色质免疫共沉淀的 DNA 样品纯化后进行 PCR 扩增， 然后用荧光素标记（如 Cy3）。对没有经过免疫沉淀反应富集的 Input DNA 样品也进行扩增， 并且用另一种荧光素标记（如 Cy5），作为结合背景的参照。之后将这两种 DNA 杂交于包括 基因组序列的微阵列芯片上，转录因子结合的靶序列用每个点相应的荧光强度来确定。

CHIP-seq：在测序深度和范围足够的情况下,ChIP-seq 可以检测到所有的组蛋白修饰所对应的 DNA 结合位点。ChIP-seq 首先通过染色质免疫共沉淀技术特异地富集目的蛋白结合的 DNA 片段,并对其进行纯化与文库构建,然后以 NGS 技术对富集到的 DNA 片段进行高通量测序。 

（NGS 技术主要是利用 DNA 新模板的合成或连接过程, 用高效平行的方式同时对 DNA 模板 进行测序, 从而获得大量的测序数据, 即所谓的大规模平行测序。）