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    三天征服Chip的经验分享

    发布时间: 2021-09-13  点击次数: 499次

    在科研界,CHIP 无疑是高冷的女神,在追逐的过程总是分分钟虐得体无完肤,糟心的实验结果更是分分钟想去“狗带"。征服 CHIP 的路上,有多虐心就有多少要注意的地方。庆幸的是,曾得到女神青睐的前辈们积累了不少经验。好的经验要分享,特地总结了各位高手们做 CHIP 的经验,在此奉上,希望能助大家一臂之力。

    染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,CHIP)是目前研究体内 DNA 与蛋白质相互作用的*方法,能够比较真实的反应细胞内转录因子 TF 与启动子 Promoter 的结合情况。其基本原理:在活细胞状态下,把胞内 DNA 与蛋白质交联成复合物,通过超声或酶处理将染色质随机切断为一定长度范围内的小片段,然后利用抗原抗体特异性识别反应,将与目的蛋白结合的 DNA 沉淀下来,特异性富集目的蛋白结合 DNA 片段,进而对目的片断进行纯化与检测(如 qPCR、基因芯片、测序等),从而获得蛋白质与 DNA 相互作用的信息。

    CHIP 主要分为两种:交联染色质免疫沉淀(Cross-linkedChip,XChip)和自然染色质免疫沉淀(Native Chromatin Immunoprecipitation, NChip)。两者的区别在于 XCHIP 需要甲醛固定,适合于结合力较弱的 DNA-蛋白质相互作用的研究;而 NCHIP 则不需要甲醛固定,不需要交联反应,主要用于组蛋白修饰(如组蛋白 H3 和 H4,它们本身与 DNA 结合非常紧密)、核小体定位的研究。在 NCHIP 中,DNA 结合蛋白与 DNA 之间保持一种自然状态,需要采用微球菌核酸酶对染色质进行消化。 一般而言,我们所提的染色质免疫共沉淀指的是 XCHIP。那么长话短说,将 XCHIP 三天实验中的常见流程及注意事项分享给大家。 


    第一天 

    细胞的甲醛交联 

    1)收集细胞,加入甲醛(终浓度为 1%),37℃孵育 10min 后,加入甘氨酸(终浓度为 0.125M),混匀后在室温下放置 5min 即可。 

    2)离心弃上清,收细胞于 15ml 离心管中,用 3ml 预冷的 1×PBS 洗两次后,预冷后 2000rpm  5min 收集细胞。 

    3)弃上清,按照细胞量,加入 SDS Lysis Buffer,使细胞浓度为 1×106 个/100 ul。再加入蛋白酶抑制剂复合物。

    Tip: 

    1、细胞生长状态要好,因其生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络,可能会影响你所研究的 TF 与 Promoter 的结合。因而,一般细胞长到 75%-80%比较好。

    2、交联程度会影响到超声破碎的效果,交联程度越高,超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段,背景色加深;交联不充分,则只有一部分靶蛋白与 Promoter 结合,富集得到的 Promoter 的量不高,产生实验假阴性。建议样品交联的时间为 2-30min。 

    3、用 SDS 重悬细胞时,要选用小的 tip 头,在液面下吹打,否则很容易产生气泡,会对后续超声破碎带来不便。


    超声破碎 

    1)冰上孵育 10min 后,利用超声波或微球菌酶将染色质随机切为 200~1000bp 的小片段。 14000rpm 离心 10min(4℃),转移上清于 1.5ml EP 管中。 

    2)取出 100ul 超声破碎产物,加入 4ul 5M NaCl(终浓度为 0.2M),65℃处理 4h 进行解交联,电泳检测超声破碎的效果。 

    3)另取出 100ul 超声破碎产物,加入 900ul ChIP Dilution Buffer 和 20 ul 的 50× PIC,再加入 60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA,去除非特异性。4℃颠转混匀 1h 后,1000rpm 离心 3min,收集上清。

    Tip: 

    1、不同细胞系需不同的超声时间才能达到*效果,则可通过时间梯度的超声来选择*超声条件。

    2、每份超声样品取 50ul,标记为 input,用于定量 DNA 浓度(稀释 200 倍,测 OD260)和作为 PCR 空白对照。同时超声后样品应立刻存于-70℃中,避免多次反复冻融。 

    3、加入 Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA 之前一定要混匀,因为 Salmon sperm DNA 是很粘稠的物质,若不混匀,后面 beads 量不一样,对实验结果产生影响。


    第二天 

    免疫共沉淀

    1)一管加入 1ul 抗体,另一管中则不加抗体作为对照。4℃颠转过夜。 

    2)孵育过夜后,每管加入 60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA,沉淀抗体/抗原复合物, 4℃颠转 1h。1000rpm 4℃ 3min 收集沉淀,弃上清。 

    Tip: 

    1、每个样品都采用 25ug 的 DNA 量,同时抗体的量为 1-10ug 的抗体/25ulDNA。 

    2、单抗与多抗的选择也需慎重考虑。单抗特异性强,背景低,但是识别位点单一,在 CHIP 甲醛交联过程中,很有可能该位点被其他蛋白或核酸结合而被封闭,导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没有此问题,但是特异性差,背景可能会偏高。一般建议选择多抗;选择单抗时要注意其识别位点需远离靶蛋白与核酸结合的区域。


    纯化 DNA 片段 

    1)依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗过程:加入溶液 1ml,在 4℃旋转 5min,1000rpm  3min,去除上清。 

    洗涤液: 低盐免疫复合物洗脱液,洗一次;高盐免疫复合物洗脱液,洗一次;氯化锂免疫复合物洗脱液,洗一次; TE Buffer,洗两次。

    2)清洗完毕后,进行洗脱。每管加入 250ul 洗脱液,室温下颠转 15min,1000rpm 3min,收集上清液。最终的洗脱液为每管 500ul。

    洗脱液: 100ul 10% SDS,100ul 1M NaHCO3 ,800ul ddH2O ,共 1ml。 

    3)解交联:每管加入 20ul 5M NaCl(终浓度为 0.2M),混匀后,65℃解交联过夜。

    Tip: 

    1、洗涤时,前几个步骤可以不用洗的太干净,但最后一个要尽量吸取干净,必要时可用 gel  loading tips 吸取上清液。 

    2、含 beads 的样品离心时,转速不能太快,防止 beads 破碎,但如果采用的是磁性的 beads 就不存在这个问题。 

    3、解交联时,建议在离心前,先把蒸发到离心管盖子上的部分离下来。


    第三天 

    DNA 样品的回收 

    1)每管加入 1ul RNaseA(MBI),37℃孵育 1h。 

    2)每管加入 10ul 0.5M EDTA,20ul 1M Tris.HCl(pH 6.5),2ul 10mg/ml 蛋白酶 K。45℃处理 2h。

    3)DNA 片段回收—OMEGA 胶回收试剂盒,最终的样品溶于 100ul ddH2O

    Tip: 

    1、样品中 SDS 含量较高时,普通 PCR 回收试剂盒进行 DNA 片段回收时,在过柱前,可在样品中加入一定量的异丙醇,这样可有效消除 SDS 沉淀。 

    2 、一个 CHIP 一般需要 3~4 天时间,其中有几个步骤是可以停下来的: 

    (1)细胞收集:用含蛋白酶抑制剂的 PBS 洗涤离心,去上清的细胞收集液可置-80℃冻存; 

    (2)用 SDS 重悬细胞后可置-80℃冻存; 

    (3)超声破碎结束时,离心后的上清置新的离心管后可置-80℃冻存;

    (4)解交联后的标本可置-80℃冻存


    DNA 样品分析 

    如果目的蛋白的靶序列已知,或怀疑某一序列是目的蛋白靶序列,可选用定量或者半定量 PCR 方法。如果目的蛋白的靶序列未知或要研究目的蛋白基因组分布情况,找出转录因子结合位点,则可采用 CHIP 克隆测序(CHIP-seq)、CHIP-chip 等方法。

    PCR 分析 

    目前检测方法主要有 3 种: 

    CHIP-qPCR:用于比较沉淀的模板与阴性和阳性对照信号强度的相对精确的定量 PCR 方法。成本较低。此外,还有一些由 ChIP 衍生出来的方法,如 RIP(即用 ChIP 的方法研究细胞内 蛋白与 RNA 相互结合,具体方法和 ChIP 差不多,只是实验过程中要注意防止 RNase,最后 分析时需先将 RNA 逆转录为 cDNA)

    Tip : 

    1、1~10ul 的移液枪取 3ul 以上才比较准确,要考虑好自己 PCR 反应体系的配置。 

    2、每次 qPCR 之前都要把 sample 离心保证取样的准确。 

    CHIP-chip:Chip 和 DNA 微阵列芯片技术结合是种高通量分析 DNA 和蛋白质结合或翻译后染 色质和组蛋白修饰的方法。即将经过染色质免疫共沉淀的 DNA 样品纯化后进行 PCR 扩增, 然后用荧光素标记(如 Cy3)。对没有经过免疫沉淀反应富集的 Input DNA 样品也进行扩增, 并且用另一种荧光素标记(如 Cy5),作为结合背景的参照。之后将这两种 DNA 杂交于包括 基因组序列的微阵列芯片上,转录因子结合的靶序列用每个点相应的荧光强度来确定。

    CHIP-seq:在测序深度和范围足够的情况下,ChIP-seq 可以检测到所有的组蛋白修饰所对应的 DNA 结合位点。ChIP-seq 首先通过染色质免疫共沉淀技术特异地富集目的蛋白结合的 DNA 片段,并对其进行纯化与文库构建,然后以 NGS 技术对富集到的 DNA 片段进行高通量测序。 

    (NGS 技术主要是利用 DNA 新模板的合成或连接过程, 用高效平行的方式同时对 DNA 模板 进行测序, 从而获得大量的测序数据, 即所谓的大规模平行测序。)


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