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    WB的免疫印迹操作分享

    发布时间: 2021-09-14  点击次数: 794次

    ①膜处理(甲醇 1min,风干(放滤纸上),甲醇 1min,水 1min) 

    ② 封闭(用 TBST 配 5%牛奶)1h 配摇床 

    ③ 加一抗,牛奶稀释,所需浓度参考抗体说明书,看膜的大小配多少一抗,4°过夜。 

    ④ 室温孵育 20min 

    ⑤ 0.1%TBST 洗 10min x 3 次配摇床(0.1%TBST:tris12.1g,NaCl87.66g,HCl 至 PH7.6 后定容至 1L 后,加入 1ml 的 TWEEN20) 

    ⑥ 加二抗,牛奶稀释,一般 1:10000,1h 配摇床 

    ⑦ 0.1%TBST 洗 10min x 3 次配摇床 

    ⑧ 发光(A 液 B 液等体积混合,孵膜 1min,正面朝上放入仪器内发光)


    经验总结: 

    封闭液的选取具体得看抗体说明书,有的抗体是明确要求只能用 BSA,而且封闭液浓度的选择也是具体得看抗体的要求,但是一般情况 5%BSA 的效果会比 5%牛奶要好。 信号通路一般都是用 5%BSA 封闭。 信号通路在洗膜的时候用快速摇床 5min/次 3 次就可以了。 如果你想省时间,一抗可以放在 37℃1~2hour,但是一定要封好,以免温度太高而导致抗体 干了出现假阳性。二抗可以 37℃半个小时。 发光液的选取,如果是一般的抗体,建议用一般的发光液效果会好一点,如 keygen 的,背景会比较干净。但是一些难发出来的一般建议用灵敏度更高的发光液如 FD 的或者是 MILLIPORE 之类的发光液。

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