销售热线

19126518388
  • 技术文章ARTICLE

    您当前的位置:首页 > 技术文章 > 搞定内参,驾驭 Western blot 已成功一半

    搞定内参,驾驭 Western blot 已成功一半

    发布时间: 2021-09-15  点击次数: 231次

    western blot 对绝大多数实验新人而言,绝对是心中痛,一碰就要抓狂。没办法,谁让导师发话了,WB 做不好,延毕就是分分钟的事儿。这还真是让小伙伴们感叹道,WB 想说爱你不容易。那么为了彻底驯服 WB,获得漂亮且理想的实验结果,一个良好的参照体系就绝对是不可或缺的存在。 

    一般而言,良好的参照体系包括: 

    *体重计(分子量 marker):可确定蛋白条带对应的分子量大小 

    *光杆司令(空白对照):不加一抗和二抗,用于检测膜的性质的封闭效果 

    *好榜样(阳性对照):已知量标准产物的正对照,可检测抗体的工作效率


    *打酱油的(阴性对照):不表达靶蛋白的组织或样品,检测抗体的特异性 

    *单飞者(二抗对照):不加一抗,检测二抗的特异性。 

    *校正者(内参对照):检测标本系统和抗体系统,减少蛋白定量、上样过程中的误差



    内参君的初次登场 

    在此,小编就带领大家一起来认识认知这位“有名"的内参君吧。内参(Internal Control),简而言之,一般指的是由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins),因其表达恒定被用于检测蛋白表达水平变化时的参照物,可确保实验结果的准确性。



    搞定内参,驾驭 Western blot 已成功一半

    Tips: 

    1)在一些文献报道中,Erk2、TATA bindingprotein(TBP)以及 c-Jun、c-Fos 等也可被用于核蛋白的内参。 

    2)内参的选择需要考虑实际的实验环境。 

    eg:在细胞增殖相关试验中,c-Jun 由于自身表达变化就不适合做内参;而在凋亡实验时,TBP、Lamin 等也不适合作为内参。因此设计实验方案的时候应该考虑这些因素并查询相应文献,在实验过程中也应该注意如果内参表达出现异常,应考虑这方面因素。



    搞定内参,驾驭 Western blot 已成功一半



    锋芒毕露的内参君 

    正所谓,养兵千日,用在一时。可是很多实验菜鸟在选好内参之后,对下一步如何发挥内参君的本领感到一愁莫展。那么以下三个妙招可一解大家的燃眉之急。 

    1、超级简便的标记内参使用法:只要在二抗孵育时加入 HRP 标记内参抗体,按照正常操作即可。 

    2 、普通内参:当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时,可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用膜再生液(P1650)洗掉膜上的抗体,重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。

    3 、当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下,可以在转膜后预染,根据蛋白质 Marker 的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分,使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育,二抗温育以及显色。 如此下来,各位小伙伴就可以坐等锋芒毕露的内参君为我们擒获漂亮且理想的内参图片。





在线咨询
咨询热线

0759-5588931

[关闭]