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    盘点RACE技术的几种类型及特点

    发布时间: 2021-09-16  点击次数: 929次

    在分子生物学中,未知基因全长序列的获取是研究新基因的重要步骤。当我们不清楚目的基因的完整序列时,获得未知序列的方法有反向PCR、mRNA差异显示技术、基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等等......


    背景介绍

    今天我们来一起了解一种可从低丰度转录本中获得cDNA末端序列的方法—RACE技术。当我们不清楚目的基因的完整序列,只知道其中的一段序列时,就可以通过RACE技术获得mRNA两端序列,再与已知序列拼接,从而得到完整mRNA序列。相比其他获得mRNA全长的技术,RACE具有简单、快速、廉价的优势,因而得到较多的运用。


    RACE是什么?

    RACE全称为rapid amplification of cDNA end,即cDNA末端快速扩增技术,就是已知部分cDNA序列,基于mRNA逆转录和PCR技术获得完整的cDNA的 3'或5'末端的分子生物学技术。


    RACE可以应用在哪些实验方向?

    构建cDNA文库

    lncRNA全长克隆

    获得抗体可变区序列

    miRNA靶基因序列验证

    已知基因一段序列,克隆旁侧序列

    获得病毒基因组

    ......

    总体来说,就是用来测定cDNA序列,获得RNA全长序列。


    RACE技术类型及特点?

    RACE技术有多种类型,根据各个RACE技术原理的不同,适合于不同的RNA,快来跟着小编一起来了解下吧~

    经典RACE

    经典RACE技术是在1988年由Frohman等[1]发明。经典RACE技术包括5'RACE和3'RACE,分别克隆cDNA的5'端和3'端。


    盘点RACE技术的几种类型及特点

    1. 3'RACE利用真核生物mRNA 3'端具有poly A结构的特点,使用5'端带有接头序列的oligo dT与之结合进行逆转录,获得cDNA;

    2. 再利用根据已知序列设计的上游引物和与接头序列互补配对的下游引物进行PCR扩增,得到cDNA 3'末端扩增产物。

    盘点RACE技术的几种类型及特点

    1. 经典RACE技术中的5'RACE是利用根据已知序列设计的下游引物GSP作为逆转录引物,合成一链cDNA;

    2. 末端脱氧核苷酸转移酶在新合成的cDNA 3'末端加上poly A;

    3. 带有接头序列的Oligo dT引物与一链cDNA 3'末端的poly A结合,合成二链cDNA;

    4. 再以第二链cDNA为模板,利用GSP和接头引物作为上下游引物进行PCR扩增,得到cDNA 5'末端扩增产物;

    得到的5'末端产物和3’末端产物可以通过克隆连接到适当的载体上,进行测序获得末端序列。将测序得到的cDNA末端序列,与已知的中间序列进行拼接,就可获得cDNA全长序列。


    经过科学技术的发展,由经典RACE又衍生出多种RACE技术,增加了RACE技术的适用广泛性,我们再来一起了解下其他的RACE技术吧!

    Cap-switching RACE

    Cap-switching RACE针对mRNA发生断裂的可能,进行了技术优化[2-4]。


    盘点RACE技术的几种类型及特点

    1. Cap-switching RACE是以Oligo dT作为逆转录引物,逆转录获得一链cDNA;

    2. 当逆转录到mRNA的5'帽子结构时,莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV)会在新合成的cDNA的3'末端加上若干个胞嘧啶;

    3. 接着,使用5'端带有接头、3'端带有poly G结构的接头引物与cDNA 3'端的poly C互补配对,逆转录酶继续以接头为模板合成cDNA,完成接头转化,新合成的一链cDNA 3'端就含有一段接头序列;

    4. 然后再利用接头引物进行PCR获得RACE产物。

    RLM-RACE

    RLM-RACE技术的出现同样也是为了扩增到完整mRNA的5'末端,避免mRNA断裂带来的影响。


    盘点RACE技术的几种类型及特点

    1. 首先在RNA体系中加入牛小肠碱性磷酸酶(CAP),特异性地识别并切除断裂mRNA 5'端暴露的磷酸基团;

    2. 再向体系中加入烟草酸焦磷酸酶(TAP),切除mRNA 5'端完整的帽子结构,使mRNA 5'端暴露出一个磷酸基团;

    3. 接着加入RNA连接酶将接头与mRNA 5'端暴露的磷酸基团连接,而切除了磷酸基团的断裂RNA则不能与接头结合,这样便获得了5'端带有接头的完整mRNA;

    4. 最后再进行RT-PCR

    Adapter-Ligated RACE

    Adapter-Ligated RACE技术同样是为了获得更长的mRNA序列,但相对来说不一定能获得全长mRNA序列[5]。


    盘点RACE技术的几种类型及特点

    1. 向逆转录获得的cDNA体系中加入T4连接酶,利用T4连接酶将接头连接到cDNA两个末端上;

    2. 短cDNA的退火温度低,两端接头容易发生退火,形成锅柄状结构;

    3. 长的cDNA退火温度高,不易形成锅柄装结构,因此引物可以与接头结合,进行PCR扩增。


    环形-RACE

    环形-RACE使用一对基因特异性引物进行扩增,提高了PCR扩增的特异性[6]。

    1. 环形RACE是利用T4连接酶将cDNA的末端连接,形成cDNA的环化结构或串联结构;

    2. 根据mRNA上的已知区域设计特异性引物GSP,以GSP引物合成第二条cDNA链;

    3. 在未知序列两端根据已知序列设计一对GSP进行PCR扩增,将未知序列置换到已知序列中间位置,得到中间是未知序列、两端是已知序列的扩增产物。



    RCA-RACE

    RCA-RACE (rolling circle amplification rapid amplification of cDNA ends)类似于环形RACE,但是RCA-RACE在环化的过程中并不会产生串联结构,PCR扩增过程中所使用的引物既可以是特异性引物,也可以是随机引物。PCR扩增使用φ29聚合酶,这种酶的特点是会把酶前行方向上的前链从原来的模板链上进行解链、移开。RCA-RACE利用这种特点,可以让模板上的每个点在第一轮反应中,都有机会得到n个拷贝,产物呈指数扩增。

    RCA-RACE利用ATP依赖性的热稳定连接酶,将一条cDNA末端的5'磷酸基团和3'羟基连接,形成单分子环状DNA。再使用随机引物或基因特异性引物,在φ29 DNA聚合酶的催化下进行PCR扩增,扩增产物呈指数增长。


    RACE的技术特点对比

    盘点RACE技术的几种类型及特点

    基于RACE技术原理,以下几点可提高RACE实验的成功率:

    1. 保证RNA模板的完整性。实验之前最好进行琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整性。

    2. 使用高特异性引物。如使用Vazyme的RACE引物设计软件,软件会给出多条合适的RACE引物,可选择多条基因特异性引物进行RACE实验,提高成功率。


    3.巢式PCR。应用巢式PCR设计引物时,在引物中加入特异性序列和适当的酶切位点,一方面可以增加对目的片段的特异性克隆,另一方面也方便后续的测序和实验


    安培可以提供

    HiScript-TS 5'/3' RACE Kit(Vazyme #RA101)基于Cap-switching RACE原理开发,试剂盒中包括5'RACE和3'RACE的所有组分,可分别获得5'RACE和3'RACE的产物。

    原理图如下:


    盘点RACE技术的几种类型及特点

    成功率高:经测试RA101阳性率可达到70 %以上

    操作流程简便、体验感优:步骤简化,一管内完成模板转换和一链cDNA合成;组分Mix形式,减少加样步骤、降低加样所带来的污染

    配套RACE引物设计软件和序列比对软件:包含RACE实验引物设计软件和序列比对软件,以及使用说明文件,简化RACE实验设计环节


    【参考文献】

    [1] Frohman M A,Dush M K,Martin G R. Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide prime[J]. Proc. Nat. Acad. Sci. USA,1988,85( 23) : 8998 - 9002.

    [2] Matz M,Shagin D,Bogdanova E,et al. . Amplification of cDNA ends based on template-switching effect and step-out PCR[J]. Nucl. Acid Res. ,1999,27( 6) : 1558 - 1560.

    [3] Schramm G,Bruchhaus I,Roeder T. A simple and reliable 5- RACE approach[J]. Nucl. Acid Res. ,2000,28( 22) : e96.

    [4] Schmidt W M,Mueller M W. CapSelect: a highly sensitive method for 5'CAP-dependent enrichment of full-length cDNA in PCR-mediated analysis of mRNAs[J]. Nucl. Acid Res. , 1999,27( 21) : e31.

    [5] Chenchik A,Diachenko L,Moqadam F,et al. . Full-length cDNA cloning and determination of mRNA 5' and 3' ends by amplification of adaptor-ligated cDNA[J]. Biotechniques, 1996,21( 3) : 526 - 535.

    [6] Maruyama I N,Rakow T L,Maruyama H I. cRACE: a simple method for identification of the 5' end of mRNAs[J]. Nucl. Acid Res. ,1995,23( 18) : 3796 - 3797.

    [7] 徐烨, 刘雅婷, 代文琼,等. 几种主要的RACE技术及应用 [J]. 中国农业科技导报, 2012, 014(002):81-87.



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