冻存细胞的这些坑，你踩过吗？

冻存细胞的错误时机主要有：细胞量太少，细胞状态不好，细胞变形严重，或者细胞生长堆积，一旦生长过平顶期，培养基就会变得很黄，细胞可疑污染；镜下观察细胞有很多碎片或者不明物；培养时间过长，连续培养超过二个月，细胞性状已有改变。

选择细胞冻存的最佳时机：细胞增殖旺盛，情况稳定，试验效果良好，复苏后两周内开始冻存一批，再往下传的用来做实验。

细胞太少

冻存时细胞浓度低于1- 5*10^5CELL/VIAL,复苏很难成功,原因：细胞和细胞间会又间隙接触反应, 解决：离心后调整细胞浓度，把细胞种更小的孔板中.

培养基很黄，冻存细胞后复苏不长

在细胞生长平顶期冻存的细胞会在解冻后有几天停滞状态，原因：细胞在生长平顶期已经停止生长，冻存后也保持互相间抑制的信号，解决办法：用胰酶消化重新铺板；

细胞污染或者很多小黑点

冻存管的盖子一定要拧紧，否则复苏水浴时会渗水，造成污染。复苏细胞的时候尽量避免冻存管接缝处沾水，防止支原体污染，实验室定期用过氧化氢熏蒸，细胞小黑点增多时用支原体检测试剂盒检测，并且及时清除，趁高温假给细胞来次清洁吧，支原体去除试剂，*防止支原体污染好帮手。

程序降温盒导致的细胞复苏不活

放在－80 度的冻存盒，壁太薄，细胞在被迅速降温，使用普通的冻存液抗氧化和抗冻添加物不够，导致细胞内产生大量冰晶杀死细胞.

推荐品牌无血清细胞冻存液，冻存液含有抗氧化因子，可在细胞冻存时防止细胞产生氧化反应，给细胞一个好的休眠环境，含有抗冻组分，让大部分细胞免受冰晶杀戮，好不好用一下就知道！

-80°存放太久导致的细胞复苏不好

原因：冰箱的温度难以恒定：开门 / 关门过于频繁，冰箱电压不稳等.解决办法：尽快转入液氮。

液氮不足

液面不能漫过所有细胞。解决：定期测量液氮储备，保证细胞全部浸在液面下，小提醒：有几个细胞需要气相保存的，不能浸入液氮里，挪细胞的时候需要注意一下。

取错细胞

找不到 / 拿错冻存管。原因：没有标记好细胞，没有做好库存记录，解决：冻存细胞时在每支冻存管都标上细胞的名称，冻存时间，并记录在册。