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    实验分享:血脑屏障实验的操作步骤

    发布时间: 2021-09-30  点击次数: 523次

    从19世纪末,保罗·埃尔利希在一个实验中发现了这个屏障,后期科学家跟进研究后发现血脑屏障(BBB)对机体发挥着重要作用。BBB结构和功能的完整对于维持神经元功能,使中枢神经系统免受病原体、炎性因子、损伤的影响有重要意义。缺血性脑血管病的发生、发展与BBB结构和功能的破坏密切相关。


    一. 实验试剂准备:


    1. 准备好无钙镁离子PBS磷酸盐缓冲液,cell systems人脑微血管内皮细胞(货号:ACBRI 376)建议使用无钙镁离子的缓冲液实验.

    2. 通过稀释 0.5 mg/mL 纤维素溶液和 0.3 mg/mL 胶原蛋白 IV 溶液,在 1.5 mL 微管中分别使用 1x PBS 至 100 mg/μL 等分,制备 10 μg/mL 胶原蛋白 IV 和 10 μg/mL 纤维素溶液。此后,将两种等分的100μL与1,800μL的1x PBS混合在2 mL微管中,并将其储存在-20°C。也可使用cell systems原代细胞专用包被液(货号:4Z0-201),铺板后静等2分钟,吸掉包被基质,直接铺板细胞,节约时间,简单方便。

    3. 预备好培养基,cell systems原代细胞经典培养基(货号:4Z0-500)包含包被液和生长因子,并且不含抗生素。

    4. 准备胰酶,在 50 mL 管中稀释 45 mL 的 1x PBS 的 10x 浓缩胰蛋白酶-EDTA 溶液的 5 mL,制备 1x 胰蛋白酶-EDTA 溶液并将其储存在 4°C,也可以cell systems传代套装(货号:4Z0-800),包含PBS,胰酶,胰酶中和液,一套解决所有消化试剂的准备问题。

    5. 在 500 mL 玻璃瓶中称量 10 g LB 肉汤,制备 500 mL LB 介质。加入500 mL的消毒水,并高压灭菌。

    6. 在 500 mL 玻璃瓶中称量 10 g LB 肉汤和 7.5 g 的琼脂,准备 LB 琼脂。在高压灭菌前加入500 mL的消毒水,不要关闭烧瓶盖。高压灭菌器,让溶液冷却,直到可以接触。


    二.血脑屏障细胞的生长


    1. 使用12 孔板,请将细胞包被液种到孔里。

    2. 将板和每个刀片解压在生物安全柜中,并在那里执行进一步步骤。使用消毒钳抓住刀片在其宽基上移动它。

    3. 用90μL的10微克/mL胶原蛋白IV和10μg/mL纤维蛋白混合物覆盖每个刀片的多孔膜。之后放入细胞培养箱中孵育24小时,在37°C下孵化。

    4. 将 1 mL 的 1x PBS 移入每个刀片,然后用真空泵吸出溶液,用于细胞培养,将刀片洗涤两次。

     注意:若使用cell systems细胞包被液,前三的步骤可省略为:使用移液管将包被液移入孔板里,静等2分钟后吸出,无需清洗,直接执行第四步。

    5. 通过在上部移液 0.5 mL 的预热 cell systems经典细胞培养基和下腔室的 1.5 mL 来平衡膜。在具有5%CO2大气的细胞培养箱中,在37°C下孵育30分钟

    6. 种子2 x 105人类微血管内皮细胞进入每个上腔,并在细胞培养箱中以37°C孵育12孔板。

    7. 使用真空泵从细胞培养液中吸出培养基,然后通过移液 10 mL 的 1x PBS 清洗单层,然后用真空泵对溶液进行吸气。

    8. 将5ml的培养基吸出培养瓶,用1x浓缩胰蛋白酶-EDTA完全覆盖细胞。在细胞培养箱中37°C下孵育烧瓶3-5分钟。注:如果细胞未分离,请轻拍培养瓶让细胞脱落。

    9. 加含有血清的培养基中和

    10. .在 210 x g下将悬浮液离心 3 分钟,用真空泵去除上清液,用移液器将细胞重新悬浮在 5 mL 的培养基。

    11.  将细胞悬浮液的10μL与10μL的0.4%台盼染色剂混合在1.5 mL微管中,使用细胞计数器。将10μL的混合物加入计数室滑块,放入细胞计数器,然后开始计数。

    12. .将计数器聚焦在单元格上,使其边缘为深蓝色和中间白色。之后,启动适当的细胞计数程序。

    13.要计算每个刀片的体积,请将每刀片获得的 2 x 10^5个单元格的细胞悬浮液的计算浓度分开。


    三. 血脑屏障模型的培养


    在37°C下孵育12孔板14天。

    上腔室的培养基每天更换 0.5 mL,下腔培养基每 2-3 天更换 1.5 mL。在更换培养基之前,请先预热。真空泵吸气,避免产生气泡注意:小心工作,避免接触膜。

    通过显微镜成像细胞,检查细胞的状态,并确定汇合。确保14天后汇合度为100%。


    四. 细菌的制备


    1. 测量前一天,将大肠杆菌菌株的菌群复苏在LB培养基里。在37°C下孵育培养24小时,在孵育摇床中孵育180rpM

    2. 在 4°C 的 LB 琼脂板上培养大肠杆菌菌株。取一个带消毒的采摘管,并将采摘放入具有 3 mL LB 琼脂培养基制备的培养管中。

    3. 为每个刀片准备一个 LB 琼脂板,并填充培养皿,将其总体积减半。让他们变成固体,并存储在4°C。


    五.  细胞的药物实验


    1. 播种后的第14天,用化合物处理细胞或测量转皮电阻(TEER),。

    2. 要是由感兴趣的化合物处理细胞,将该化合物稀释到调整好浓度稀释到完全培养基中。将0.5 mL的混合物加入上腔室,将1.5 mL添加到下腔。再次进行培养。之后,通过真空泵吸气和移液进行正常的细胞换液处理。


    六. 渗透性测量


    1. 为了获得恒定的细菌浓度,用波长为600纳米的光度计测量光密度。用LB培养基在50 mL falcon管中将过夜的细菌溶液稀释至OD600为0.5±0.05。在冰上工作。

    2. 向比色皿中加入1毫升LB培养基。启动光度计,将比色杯放入,标记侧朝前。按下底部“空白",然后测量空白值。

    3. 将细菌溶液注入比色杯中,放入比色杯中,然后按压底部样品,测量细菌溶液的密度。在稀释过程中重复测量,直到获得最终浓度。

    4. 在生物安全柜中工作,可使用准备好的12孔板和OD600=0.5的细菌溶液处理细菌。仅向每个含有0.5 mL培养基的上腔中添加450µL细菌溶液。

    5. 在37°C的培养箱中培养12孔板6小时。

    6. 用移液管从每个下腔取50µL培养基样品,方法是用镊子取下插入物。注意不要将培养基从上腔溅到下腔。

    7. 将每个样品置于单独的琼脂平板上。将样品滴在平板上,用细胞撒布器划出溶液。

    8. 在37°C的培养箱中培养琼脂平板24小时。

    9.计算每个平板中的菌落数



    CELL SYSTEMS血脑屏障部分参考文献:

    1."Cysteinyl leukotriene receptor type 1 antagonist montelukast protects against injury of blood–brain barrier" Zhou et al. Inflammopharmacology, 2019

    2."Alterations of the Endocannabinoid System in Post-ischemic Endothelial Cells of the Blood Brain Barrier" Thurston (Dissertation) 2019

    3.Exosome-Mediated Transfer of ACE2 (Angiotensin-Converting Enzyme ) from Endothelial Progenitor Cells Promotes Survival and Function of Endothelial Cell" Wang et al. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2020

    4."RAGE and CCR7 mediate the transmigration of Zika-infected monocytes through the blood-brain barrier" Costa de Carvalho et al. Immunobiology, 2019

    5."Binding Heterogeneity of Plasmodium falciparum to Engineered 3D Brain Microvessels Is Mediated by EPCR and ICAM-1" Bernabeu et al. mBio, 2019

    6."In Vitro Cell Models of the Human Blood-Brain Barrier: Demonstrating the Beneficial Influence of Shear Stress on Brain Microvascular Endothelial Cell Phenotype" Rochfort and Cummins et al. Blood-Brain Barrier, 2018

    7."Modulation of glucocorticoid receptor in human epileptic endothelial cells impacts drug biotransformation in an in vitro blood–brain barrier model" Ghosh et al. Epilepsia, 2018.




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