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    【外泌体应用】天然纳米药物载体

    发布时间: 2021-10-08  点击次数: 660次

    外泌体是来源于细胞内膜的30-180 nm的脂质双层包裹的囊泡,包含有核酸、蛋白质和脂质等生命物质,在细胞外环境中循环,是细胞间通讯工具。外泌体在形成的过程中,会把一些蛋白质、活性酶囊括在内以及携带一系列的寡核苷酸,特别是线粒体DNA,mRNA,miRNA和许多其它非编码RNA等。因而外泌体是天然的多功能载体,可以包裹并递送各种生命物质,例如小RNA、mRNA和蛋白质等。相对于脂质体和病毒载体,外泌体稳定性高,生物相容性好,免疫原性低,而且可以渗透生物屏障(例如血脑屏障、胎盘屏障),故外泌体作为天然纳米型药物递送载体有着巨大应用前景。

    外泌体作为药物载体的优势


    生物来源的外泌体作为载体,具备良好的生物相容性,生物可降解性,低毒性,稳定性以及低免疫原性。


    首先,外泌体是纳米级囊泡,具有稳定的磷脂双分子层结构,可以装载大量的水溶性物质。其次,外泌体表面有很多跨膜蛋白,在结构上还具有可改造性,通过基因修饰,实现体内靶向治疗。此外,外泌体自身具有细胞选择性与组织特异趋向性,可以通过血脑屏障和穿透致密结构组织。而且在治疗上,外泌体载体还有易于注射和防止血管堵塞的特点。总而言之,天然的外泌体在药物递送和疾病治疗有着巨大的潜力。


    外泌体加载药物的方式


    1、外泌体直接加载药物


    电穿孔法是将药物加载到外泌体中比较成熟的方法。电穿孔法的原理是将外泌体和药物悬浮液暴露在电场中,外泌体膜上短暂的高压脉冲下会产生无数的孔,药物小分子则渗透到外泌体中。电穿孔方法简单且省时,但高压脉冲会使外泌体聚集,降低药物加载效率。


    除了电穿孔法外,还有其他方法将药物加载到外泌体,如药物和外泌体直接混合,超声处理,转染试剂等。超声处理是一种应用超声波将药物加载入外泌体的方法,具有高载药效率和持续药物释放的优点。



    2、外泌体分泌前加载药物


    药物与细胞一起孵育的方式,可以将药物通过分泌外泌体释放到培养基。即先将药物载入到源细胞中,通过分离纯化获得载药外泌体。另外还有比较常用的一种方法是转染,即将小分子RNA转染至源细胞。


    间充质干细胞(MSCs)因其在肿瘤微环境中的定位能力而被应用于输送抗癌药物。Pascucci等发现经紫杉醇(PTX)诱导后,骨髓MSCs分泌的外泌体载有紫杉醇,通过超速离心将外泌体分离出来,研究其对人胰腺癌细胞株的影响,结果表明负载紫杉醇的MSCs分泌的外泌体含大量紫杉醇,具有较强的抗肿瘤活性。


    外泌体递送的药物类型

    外泌体最大的特性之一是它们穿过屏障(如细胞质膜和血脑屏障)的能力,作为药物递送载体具有很大潜力,适用于递送各种化学物质、蛋白质、核酸和基因治疗剂。


    1、外泌体作为小分子药物递送载体


    肿瘤治疗需要低免疫原性和低毒性的靶向药物载体。2013年Tian等发表在Biomaterials的文章通过电穿孔将化疗药物如阿霉素(Dox)加载到iRGD肽功能化的外泌体,输送到BALB/c裸鼠的肿瘤组织中。为了降低免疫原性和毒性,使用小鼠未成熟树突状细胞(IMDC)产生外泌体。通过工程化IMDC以表达与αv整合素特异性iRGD肽融合的外泌体膜蛋白(Lamp2b),具有肿瘤靶向性。从IMDC纯化的外泌体通过电穿孔加载Dox,加载率高达20%。静脉注射靶向性外泌体将Dox特异性地输送到肿瘤组织,抑制肿瘤生长而无明显毒性。

    【外泌体应用】天然纳米药物载体

    荧光共聚焦成像,iRGD-Exos在细胞内递送Dox药物



    2、外泌体作为CRISPR-Cas9质粒的载体


    CRISPR/Cas9是一种很有前途的基因编辑技术。迄今为止,CRISPR/Cas9的细胞内运载体受到免疫原性、运载容量和低耐受性等问题的限制。McAndrews等在今年的Life Sci Alliance期刊发表文章,报告了一种基于工程外泌体的CRISPR/Cas9非病毒递送系统。


    文章表明,非自体外泌体可以通过常用的转染试剂包封CRISPR/Cas9质粒DNA,并且可以运送到受体癌细胞以诱导靶向基因缺失。在胰腺癌的原位模型中,装载CRISPR/Cas9的外泌体可以靶向胰腺癌细胞中的突变Kras G12D致癌等位基因,从而抑制癌细胞增殖和生长。外泌体是CRISPR/Cas9基因编辑靶向治疗的一个潜在递送系统。


    3、外泌体作为核酸药物递送载体


    外泌体包含miRNA、siRNA、mRNA等,说明外泌体具有对核酸药物的天然包容性。外泌体可以携带遗传基因(例如miRNA,siRNA)到靶细胞中,从而在生物学和致病过程中诱导遗传修饰。外泌体的这种特征受到了基因治疗的青睐。


    2011年Alvarez-Erviti等发表在Nat Biotechnol上文章,研究外泌体将siRNA递送到小鼠大脑。为了降低免疫原性,作者使用自体树突状细胞分泌的外泌体,通过树突状细胞表达外泌体膜蛋白Lamp2b,融合到神经元特异性RVG肽,实现了靶向。利用电穿孔法将纯化的外泌体加载外源性siRNA。静脉注射靶向外泌体将siRNA特异性传递给大脑中的神经元、小胶质细胞。


    结果表明,在治疗阿尔茨海默病的小鼠模型中,外泌体可以作为siRNA向大脑递送的有效载体。


    【外泌体应用】天然纳米药物载体

    靶向外泌体基因递送的给药示意图


    Naseri等利用从骨髓间充质干细胞中分离的外泌体(MSCs-Exo)来递送LNA(locked nucleic acid)修饰的抗miR-142-3p寡核苷酸,以抑制4T1和TUBO乳腺癌细胞系中miR-142-3p和miR-150的表达水平。体外实验结果表明,MSCs-Exo能有效地递送抗miR-142-3p,降低miR-142-3p和miR-150水平。作者还评估了MSCs-Exo在荷瘤小鼠体内的分布。体内实验结果表明,MSCs-Exo可以穿透肿瘤部位,将抑制性寡核苷酸导入肿瘤组织,从而下调miR-142-3p和miR-150的表达水平。MSCs来源外泌体可以作为可行的纳米载体递送RNA药物分子。


    【外泌体应用】天然纳米药物载体

    MSCs-Exo在荷瘤小鼠体内的分布


    4、外泌体作为蛋白质的药物递送载体


    蛋白质药物相对于基因药物更直接,但是直接进入生物体内的蛋白质药物容易引起免疫反应而被清除。已经发现外泌体可递送多种蛋白质,如酶、细胞骨架蛋白质和跨膜蛋白质等。


    Yim等2016年发表文章使用光诱导外泌体加载治疗蛋白,使用蓝光控制可逆的蛋白-蛋白相互作用模型和内源性外泌体发生过程,将蛋白质装载到外泌体中。该研究小组将蛋白治疗剂与感光色素蛋白2(CRY2)相结合,外泌体与螺旋-环-螺旋(CIBN)相结合,然后用450~490 nm波长的蓝光照射,此时蛋白质治疗剂和外泌体将会结合在一起。结果表明,该技术可诱导蛋白质治疗剂到达靶细胞,是一种高效的外源蛋白质装载方法,可以作为一种有效的将蛋白治疗药物载入到受体细胞和组织的方法。


    【外泌体应用】天然纳米药物载体

    蓝光控制可逆的蛋白-蛋白相互作用模型和内源性外泌体发生过程示意图



    Nature Biotechnology杂志去年发表文章,报道了多家大型制药公司如礼来、武田、拜耳等押注外泌体和其他细胞外囊泡,作为治疗药物递送的一种手段。Aruna Bio公司于2019年7月完成1300万美元的融资,用于支持神经外泌体递送平台的持续开发和新型神经外泌体疗法的推进。总部位于英国牛津的 Evox Therapeutics 于2017年12月宣布与勃林格殷格翰(Boehringer Ingelheim)进行合作,研究外泌体介导与RNAs药物递送,并于2018年9月获得3550万英镑的B轮融资。


    尽管外泌体作为药物载体是一个热门研究方向,但现阶段还有技术问题有待解决。其一是大规模高效生产(【外泌体研究】FiberCell为您富集高浓度的外泌体),还有就是外泌体的纯化纯化技术,对于大规模外泌体的纯化目前还没有很好的解决方案,这是目前外泌体应用上所面临的重大挑战。


    参考文献:


    • Pascucci L, Coccè V, Bonomi A, et al. Paclitaxel is incorporated by mesenchymal stromal cells and released in exosomes that inhibit in vitro tumor growth: a new approach for drug delivery. J Control Release. 2014;192:262-270. 

    • Tian Y, Li S, Song J, et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials. 2014;35(7):2383-2390. 

    • McAndrews KM, Xiao F, Chronopoulos A, et al. Exosome-mediated delivery of CRISPR/Cas9 for targeting of oncogenic KrasG12D in pancreatic cancer. Life Sci Alliance. 2021;4(9):e202000875.

    • Alvarez-Erviti L, Seow Y, Yin H,et al. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nat Biotechnol. 2011;29(4):341-345. 

    • Naseri Z, Oskuee RK, Jaafari MR, Forouzandeh Moghadam M. Exosome-mediated delivery of functionally active miRNA-142-3p inhibitor reduces tumorigenicity of breast cancer in vitro and in vivo. Int J Nanomedicine. 2018;13:7727-7747. 

    • Yim N, Ryu SW, Choi K, et al. Exosome engineering for efficient intracellular delivery of soluble proteins using optically reversible protein-protein interaction module. Nat Commun. 2016;7:12277. 


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