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    细胞消化知多少?

    发布时间: 2021-10-08  点击次数: 1282次

    每个做细胞实验的人,不管去哪“浪",心里都会有个牵挂:我的细胞,过两天要传代!

    大部分组织细胞离体培养时,会以贴壁的形式生长(除了取自血、脾或骨髓的细胞);完全培养基中的血清,含有许多带阳性电荷的促细胞附着因子(层黏连蛋白 Laminine、纤维链接蛋白 Fibronectin 等胞外基质),能帮助细胞附着于带阴性电荷的底物上(玻璃或塑料培养容器),并形成键结、贴壁伸展。

    细胞消化知多少?

    ▲ 阳性电荷的促细胞附着因子,能帮助细胞附着于带阴性电荷的底物上


    所以当细胞长满需要分盘的时后,就要想办法让细胞和培养底物说 再见!也就是所谓的细胞消化(Cell Detachment)。

    常见细胞消化法有以下三种:

    1、物理机械法

    直接用液体吹打或用刮刀,施予外力让细胞与培养底物分离;适用于贴壁性弱的细胞传代,但相较于其它消化方法,这种外力无法量化控制,细胞分散效果差,且可能会造成大量细胞破损,使内容物释放到培养基,进而影响细胞传代状态。

    细胞消化知多少?

    ▲细胞刮勺


    2、离子螯合法

    细胞膜表面蛋白大多需要钙、镁离子来维持与胞外基质的稳定键结,当然也包含各种黏附蛋白(例:整合素、钙黏着蛋白、桥粒等),螯合剂会在不破坏细胞膜表面蛋白的状况下,抽离这些离子,使黏附蛋白失活而减少细胞-细胞间及细胞-底物间的连接作用,让细胞较容易在施予外力时,脱离培养底物并促进细胞分散。

    0.02% EDTA是细胞传代较为常用的离子螯合剂,在37℃作用效果较为佳(消化较敏感的细胞可在4℃作用),适用于消化一般贴壁性细胞或细胞表面标记实验细胞。

    但EDTA无法用血清终止其反应,所以在消化细胞后必须用缓冲盐溶液(如:PBS)清洗离心,以免影响后续细胞贴盘效果。

    细胞消化知多少?

    ▲ EDTA(黑)能螯合二价离子(红)


    3、酶消化法

    用蛋白水解酶消化连接细胞及培养底物的蛋白质,适用于消化贴壁性稍强的细胞。

    (1)胰蛋白酶(Trypsin)

    为一种来自于胰腺的丝氨酸蛋白酶;能辨识并剪切胜肽链中的赖氨酸(Lys)和精氨酸(‎Arg)羧基端(两者之一紧跟脯氨酸状况除外),所以能直接作用在细胞外的黏附蛋白及胞外基质上,但如果作用时间过长,细胞膜上內嵌的其他蛋白也会被水解,导致细胞膜受损;不同细胞适合的胰蛋白酶使用浓度及作用时间都各有不同。

    使用胰蛋白酶消化前,请先用不含钙、镁离子的平衡盐溶液清洗细胞,因为血清中的抗凝血酶III及平衡盐溶液中的钙、镁离子,都会降低胰蛋白酶活性,导致消化效果不佳;消化完毕后,可直接用含血清的培养基或其他胰蛋白酶抑制剂终止消化反应。
    (2)胶原酶(Collagenase)

    为一种胶原水解酶,大多由细菌提取而来;能辨识并剪切Pro-X-Gly-Pro胜肽序列,而此序列在胞外基质主成分-胶原蛋白中出现的频率比一般蛋白高很多,使得胶原酶能较专一的作用在胞外基质上,所以对细胞的伤害比胰蛋白酶小,且在钙、镁离子环境中仍有活性,可用PBS和含血清的培养液配制,操作简便,但胶原酶价格较高,大量使用将增加实验成本。


    细胞还是不愿意跟底物说再见!咋办?

    面对贴壁性*的细胞,可进一步使用含EDTA的胰蛋白酶来消化细胞,EDTA会抓住细胞表面未洗净的钙、镁离子,降低黏附蛋白活性使细胞不会彼此粘黏,同时让胰蛋白酶在不受钙、镁离子干扰下发挥最大作用剪切胞外基质及黏附蛋白,让细胞顺利脱离培养底物且减少细胞成团现象。


    细胞消化小技巧

    不一定要一次把所有细胞都要消化下来!

    晃动培养盘并在显微镜下用肉眼观察,只要70~80%细胞都收缩了或超过适合消化时间,就该终止消化反应,如果细胞量够即可进行后续传代或实验步骤;如果细胞量不够,则可视情况用不含钙、镁离子的平衡盐溶液清洗仍贴壁的细胞,再进行一次消化反应。细胞消化知多少?


    ▲ 消化不下来的细胞(黄)请视情况决定是否再消化一次。


    不一定要吹打成完全单细胞悬液!

    一般细胞脱离培养底物、并经过5~10次轻柔吹打后,会在细胞悬液里形成小规模聚集(约5~10颗细胞),所以不需要过度延长消化时间想让细胞完全分离成单细胞悬液


    消化效果不佳,先提升消化液浓度、再加长作用时间!

    当你选定了一种消化方式 (物理机械法除外),发现效果不佳,首先应考虑提高EDTA或胰酶浓度,效果再不佳才加长消化的作用时间,避免细胞长时间浸泡在消化液中造成的细胞膜损伤。

    (一般消化液使用:0.02%~0.04% EDTA作用5-20分钟;0.2~0.5% 胰蛋白酶作用1~5分钟)


    结语

    细胞消化 ,是一个看似很简单,但是有很多技术含量的步骤。消化好坏、是否污染、有无受伤,都在这短短的五六分钟里决定。

    当我们已经可以顺利操作细胞培养实验,接下来要思考的,就是如何让细胞长得更健康、更均一、做出来的实验才会更好。

    祝各位的细胞都颗颗透亮、粒粒分明、活力旺盛!


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