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    实时荧光定量PCR的优化(三)

    发布时间: 2021-10-12  点击次数: 301次

    本期介绍设计引物,得到实时荧光PCR引物对,这种方法也可以用于普通PCR。


    1、长度应该在18~30bp,保证结合的特异性。


    2、熔解温度(Tm值)应在55~60°C,两条引物的Tm值应相差2~3°C。


    3、每条引物3'端应该有1~3个鸟嘌呤或胞嘧啶,这样做可以减少PCR过程中的非特异性扩增。超过3个时会起反作用,发生“滑动效应"导致错误延伸。


    4、引物的GC含量应该在50%左右,过高的GC含量会升高Tm值。


    5、引物中应该避免反向重复序列,因为这会形成二级结构,影响引物结合在模板上。


    6、如果是RT-PCR,还需要避免设计引物结合在外显子序列上,会导致实验结果假阳性。正确做法应设计在长内含子侧翼、或短内含子上,又或者是跨越外显子-外显子交界区。


    7、对引物进行脱盐纯化。


    需要注意的是,有时候当你做到了所有要点,引物还是有可能无法扩增,这时候就要重新设计引物啦。


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