实时荧光定量PCR的优化（三）

本期介绍设计引物，得到实时荧光PCR引物对，这种方法也可以用于普通PCR。

1、长度应该在18～30bp，保证结合的特异性。

2、熔解温度（Tm值）应在55～60°C，两条引物的Tm值应相差2～3°C。

3、每条引物3'端应该有1～3个鸟嘌呤或胞嘧啶，这样做可以减少PCR过程中的非特异性扩增。超过3个时会起反作用，发生“滑动效应"导致错误延伸。

4、引物的GC含量应该在50%左右，过高的GC含量会升高Tm值。

5、引物中应该避免反向重复序列，因为这会形成二级结构，影响引物结合在模板上。

6、如果是RT-PCR，还需要避免设计引物结合在外显子序列上，会导致实验结果假阳性。正确做法应设计在长内含子侧翼、或短内含子上，又或者是跨越外显子-外显子交界区。

7、对引物进行脱盐纯化。

需要注意的是，有时候当你做到了所有要点，引物还是有可能无法扩增，这时候就要重新设计引物啦。