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    实时荧光定量PCR的优化(四)

    发布时间: 2021-10-12  点击次数: 259次

    这期我们来学习设计TaqMan探针,应该考虑的因素有以下这些......


    1、TaqMan探针的最佳长度在20bp,不超过30bp,这样才能实现荧光淬灭。有些情况下超过30bp也是可以的,需要将淬灭基团设计在距离5'端18~25bp的地方。


    2、TaqMan探针的Tm值要比引物的高10°C,通常在65~70°C之间,确保探针比引物先结合在模板上。


    3、探针序列应该避免连续的单碱基重复序列,尤其是G,因为这可能影响探针的二级结构,降低杂交效率。


    只能使用这种单碱基重复序列时,可通过肌苷替代鸟嘌呤,中断连续。


    如果是5'端有太多鸟嘌呤,也会产生不好影响,淬灭探针的荧光。


    4、TaqMan探针的GC含量应该在50%。


    5、探针5'端应该尽可能与3'端相似,保证Taq酶快速降解探针。


    6、制备好的探针应采用HPLC纯化


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