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    实时荧光定量PCR的优化(六)

    发布时间: 2021-10-14  点击次数: 258次

    引物和探针的浓度也需要寻找最优浓度,这通常凭借经验决定。


    为什么要寻找最优浓度呢?


    因为像Taqman探针在反应过程中会被破坏,需要在起始浓度便保留足量的探针。这个浓度通常是在反应体系中达到250nmol/L。但我们不能无限制的添加探针,这会增加成本,尤其是大批量检测时,我们需要减少生产试剂的成本。


    实际探索优化中,对Taqman探针法为原理的实时荧光定量PCR实验,我们也可以使用SYBR Green I法对引物浓度进行测试,因为SYBR  Green I染料能与任意双链DNA结合,可以检测到产生的引物二聚体和其他非特异性扩增产物的量。引物二聚体会降低扩增效率和特异性,我们希望找到合适的引物浓度,减少二聚体、非特异性产物的产生。


    综上,我们需要寻找引物和探针的最优浓度,保证反应的灵敏度的同时,降低成本,并获得最大特异性。


    在实践中,我们通常推荐这样的方法来进行优化:

    1、优化引物浓度时从一个标准的浓度开始优化,每次调整浓度后制作标准曲线图,通过分析标准曲线图判断优化效果。推荐的标准优化浓度:Taqman探针法终浓度是500nmol/L,SYBR Green I法是200~400nmol/L。


    2、引物浓度效果评判的标准:标准曲线是线性的,且效率>80%,可以认为浓度是合适的,就不需要进一步优化了。


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