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    核酸提取的方法

    发布时间: 2021-10-22  点击次数: 337次

    核酸是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。

    核酸提取系列目录

    一、DNA提取方法简介

    二、DNA提取常见问题、原因分析及其对策

    三、RNA提取方法简介

    四、RNA提取及其RT-PCR常见问题、原因分析及其对策



    一、DNA提取方法简介

    1基因组DNA的提取

    1.1CTAB

    1.2SDS

    1.3其它

    2非基因组DNA的提取

    2.1、质粒DNA的提取

    2.1.1、碱裂解法

    2.1.2煮沸法

    2.2线粒体、叶绿体DNA的提取

    差速离心结合SDS裂解法

    1、基因组DNA的提取

    1.1、CTAB

    CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三呷基溴化铵),是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,并与核酸形成复合物。

    具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性,在这种条件下,蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里。

    该复合物在高盐溶液中(>0.7mol/L NaCl)是可溶的,通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

    注:CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15℃。


    CTAB提取缓冲液的经典配方

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    Tris-HCl pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;
    EDTA螯合Mg2+Mn2+离子,抑制DNase活性;
    NaCl 提供一个高盐环境,使DNP(脱氧核糖核蛋白 );
    CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;
    β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除。

    CTAB提取缓冲液的改进配方
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    PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖。

    PVP(聚乙烯吡咯烷酮)
    PVP 按其平均分子量大小分为四级,习惯上常以K值表示,不同的K值分别代表相应的PVP平均分子量范围。K值实际上是与PVP水溶液的相对粘度有关的特征值,而粘度又是与高聚物分子量有关的物理量,因此可以用K值来表征PVP的平均分子量。通常K值越大,其粘度越大,粘接性越强。
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    在研磨过程中加入PVP,其中的CO-N=基有很强的结合多酚的能力,从源头上减少了酚类被氧化的机会。
    同时向抽提液中加入还原剂β-巯基乙醇,后者能打断多酚氧化酶中的二硫键,使多酚不易被氧化,随后经抽提而去除。

    CTAB法流程图
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