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    非基因组DNA的提取

    发布时间: 2021-10-22  点击次数: 206次

    一、DNA提取方法简介

    1基因组DNA的提取

    1.1、CTAB法

    1.2、SDS

    1.3、其它

    2非基因组DNA的提取

    2.1质粒DNA的提取

    2.1.1碱裂解法

    2.1.2煮沸法

    2.2线粒体、叶绿体DNA的提取

    差速离心结合SDS裂解法

    2、非基因组DNA的提取

    2.1质粒DNA的提取

    2.1.1碱裂解法

    碱裂解法原理

    染色体DNA比质粒DNA分子大得多,且染色体DNA为线状分子,而质粒DNA为共价闭合环状分子;

    当用碱处理DNA溶液时,线状染色体DNA容易发生变性,共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象;

    变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀,而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中,从而可通过离心将两者分开。

    碱裂解法流程图

     

    图片


    SDS碱裂解法提取质粒DNA中溶液1的成分及作用

    溶液Ⅰ  50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HClpH=8.0 葡萄糖增稠,使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部;EDTA 抑制DNase的活性。这一步溶液中还可以加入RNase,不受EDTA影响,并且可以在后续步骤中被除去

    溶液Ⅱ   0.2M NaOH / 1% SDS 破细胞的主要是碱,而不是SDS,所以才叫碱法抽提

    溶液III   3M 醋酸钾 / 2M 醋酸

    这一步的K置换了SDS(十二烷基磺酸钠)中的Na,得到PDS(十二烷基磺酸钾)沉淀;SDS易与蛋白质结合,平均两个氨基酸上结合一个SDS分子,钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了,同时基因组DNA也被PDS共沉淀 

    2.1.2煮沸法

    煮沸法原理

    染色体DNA比质粒DNA分子大得多,且染色体DNA为线状分子,而质粒DNA为共价闭合环状分子;

    当加热处理DNA溶液时,线状染色体DNA容易发生变性,共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象;

    变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀,而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中,从而可通过离心将两者分开。


    2.2线粒体、叶绿体DNA的提取

    线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器,自身可编码蛋白,它们的比重和大小一定,因而在同一离心场内的沉降速度也一定,根据这一原理,常用不同转速的离心法,将细胞内各种组分分级分离出来。

    差速离心法原理

    是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。

    将待分离物质置于均匀介质(蔗糖)中,以一定的转速进行离心,比重大的物质优先沉降,比重小的却处于上层,从而得以分离。


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