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    免疫荧光技术-直接法

    发布时间: 2021-10-26  点击次数: 483次

    材料与仪器:

    抗体
    PBS 伊文氏兰
    显微镜


    实验步骤:

    1. 标本经固定后,PBS洗涤3×3 分钟;

    2. 加荧光素标记的抗体,湿盒内37 ℃孵育50 分钟;

    3. PBS洗涤3×3 分钟;

    4. 0.1 %伊文氏兰复染;

    5. PBS洗3 次,蒸馏水洗2 次,每次3 分钟,以除去NaCl结晶;

    6. 缓冲甘油封片,镜检。


    要点:
    直接法比较简单,特异性也较高,但每种荧光抗体只能检测一种相应的抗原,应用范围较窄,敏感性也较低。

    对实验结果的观察、判断与分析是影响实验结果的重要环节,判断结果的好与坏、真与假需注意以下几点。

    1、必须设立对照染色(阴性或阳性对照),没有对照染色的结果是没有说服力的。

    2、正确判断真阴性和假阳性。

    (1)了解抗原表达是否在特定部位,如VP阳性出现在神经元胞浆,Fos标记细胞胞核,若阳性产物不在抗原所在部位,通常认为是假阳性。

    (2)对阴性结果,不能视为抗原不表达,应该参考他人的结果或进行相应的对照实验,寻找原因,判断是否为真阴性。

    (3)在切片破损区域,出血坏死灶或刀痕等位置容易出现阳性表达,应鉴别分析。

    (4)染色时间的掌控很关键,可以避免非特异着色或假阳性细胞。

    3.所有免疫组化操作步骤均能影响其结果,判断的关键在于以下几点。

    (1)组织切片完整,结构清晰,说明灌注取材、脱水、制片过程中没有问题。

    (2)切片着色鲜艳,说明抗体种属之间配伍没有错误,染色步骤正常。

    (3)阳性与阴性结果部位明确,说明所用抗体的特异性强。

    4.切片例数、阳性产物数量统计、分析应符合统计学要求。



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