免疫荧光技术-直接法

1. 标本经固定后，PBS洗涤3×3 分钟；

2. 加荧光素标记的抗体，湿盒内37 ℃孵育50 分钟；

3. PBS洗涤3×3 分钟；

4. 0.1 %伊文氏兰复染；

5. PBS洗3 次，蒸馏水洗2 次，每次3 分钟，以除去NaCl结晶；

6. 缓冲甘油封片，镜检。

对实验结果的观察、判断与分析是影响实验结果的重要环节，判断结果的好与坏、真与假需注意以下几点。

1、必须设立对照染色（阴性或阳性对照），没有对照染色的结果是没有说服力的。

2、正确判断真阴性和假阳性。

(1)了解抗原表达是否在特定部位，如VP阳性出现在神经元胞浆，Fos标记细胞胞核，若阳性产物不在抗原所在部位，通常认为是假阳性。

(2)对阴性结果，不能视为抗原不表达，应该参考他人的结果或进行相应的对照实验，寻找原因，判断是否为真阴性。

(3)在切片破损区域，出血坏死灶或刀痕等位置容易出现阳性表达，应鉴别分析。

(4)染色时间的掌控很关键，可以避免非特异着色或假阳性细胞。

3.所有免疫组化操作步骤均能影响其结果，判断的关键在于以下几点。

(1)组织切片完整，结构清晰，说明灌注取材、脱水、制片过程中没有问题。

(2)切片着色鲜艳，说明抗体种属之间配伍没有错误，染色步骤正常。

(3)阳性与阴性结果部位明确，说明所用抗体的特异性强。

4.切片例数、阳性产物数量统计、分析应符合统计学要求。