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    氨甲喋呤抗性和DHFR扩增实验方法

    发布时间: 2021-10-29  点击次数: 350次
    材料与仪器

    中国仓鼠细胞或生长快的人或小鼠细胞系 氨甲蝶呤钠盐
    0.15mol LNaCl
    组织培养瓶 吸管 不含胸苷和次黄(口票)呤的培养瓶 倒置显微镜 液氮罐

    实验步骤

    1. 克隆培养亲代细胞形成生长旺盛、基因型一致的细胞群体,用于筛选。

    2. 用无菌 NaCl 0.15 mol/L ( 0.85 % ) 稀释 MTX,临床使用的包装是浓度为 2.5 mg/ml 的溶液。

    3. 在几个相同的培养瓶中分别种 2.5×105 个细胞,每个培养瓶中加入不含 MTX 或含 0.01 μg/ml、0.02 μg/ml、0.05 μg/ml 和 0.1 μg/ml MTX 的完全培养基,将培养基的 pH 调至 7.4,37°C 培养 5~7 天。

    4. 在倒置显微镜下观察细胞,如果培养瓶中出现有一小部分细胞克隆生长,其余的一些细胞是变大的,附着在基质层上的可能要死的细胞,选择这种培养瓶的细胞,换含有相同量 MTX 的新鲜培养基继续培养。

    5. 如果需要,可以更换新鲜培养基,再培养 5~7 天,但是细胞必须始终处于 MTX 环境中。当细胞密度达到 2~10×106 个/瓶,将细胞以每瓶 2.5×105 个传入新培养瓶,分别加人原浓度的 MTX 和 2~10 倍原浓度的 MTX 。

    6. 5~7 天后观察新传代的和原来加入较高浓度 MTX 的细胞,更换培养基,选择可用细胞,方法同前。

    7. 每步传代的细胞用逐步增高的药物浓度持续筛选,直至获得要求的耐药水平。改变而获得低到中等水平耐药、DHFR 活性增加和(或)转运能力改变的中同仓鼠细胞需要 2~3 个月;对于中国仓鼠细胞、小鼠细胞或生长快的人的细胞来说,获得高水平耐药性和酶过度产生的变异株需要 4~6 个月或更长时间。

    8. 定期冻存筛选中的细胞于液氮中。


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