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    成纤维细胞饲养层实验步骤

    发布时间: 2021-11-05  点击次数: 617次
    材料与仪器

    链酶蛋白酶E 用D-PBSA配制1%胰蛋白酶和1mmol L EDTA 受精后8h的胚胎 FBS
    LDF基础培养液 LDF原代培养液 LDF维持培养液 D培养液 Holtfreter缓冲液
    培养瓶

    实验步骤

    鳟鱼胚胎提取物:

    (a)收集胚胎(受精后 28 天的 Shasta Rainbow 或其他鳟鱼种系,在 10°C 条件下饲养,或者受精后 3 天的斑马鱼,在 28°C 条件下饲养),在 -80°C 条件下冻存

    (b)为了制备提取物,将约 150 g 胚胎融化后,采用 Tissuemizer 匀浆器(Tekmar ) 用 10 ml LDF 在冰上匀浆 2 min

    (c)将匀浆通过数层纱布过滤后去除绒毛膜,然后在 4°C 条件下离心(20000 g,30 min )

    (d)离心后收集上清液,留下表面的亮橘色脂层

    (e)将上清液移入 1 只新离心管,按操作步骤(c ) 离心

    (f)收集上清液,留下剩余的脂质,然后在 4°C 条件下超速离心(100000 g,60 min )

    (g)超速离心后收集上清液,留下脂层。用 LDF (1 : 10 ) 稀释上清液,然后过滤除菌

    (h)提取物过一系列滤器(1.2 μm、0.45 μm和 0.2 μm )过滤

    (i)将提取物按 0.5 ml 分装后,在 -80°C 条件下冻存

    (j)为了用提取物培养细胞,测量蛋白质浓度(见方案 21.4 ),然后用 LDF 将提取物稀释至理想的工作浓度

    (k)将稀释的提取物在 4°C 条件下冷藏,最长 2 个月

    BRL 细胞条件培养液:

    (a)在 37°C 条件下和在 75 cm2 培养瓶中,用 DMEM/F12/10FB 培养液培养 BRL 细胞(ATCC )

    (b)当细胞汇合时,用添加 2% FBS 的 LDF 置换 FD 培养液,在 37°C 条件下培养

    (c)5 天后吸出 LDF,过滤,在 -20°C 冻存

    (d)向细胞中加入新鲜的 LDF,5 天后重复此过程。条件化的 LDF 培养液可从同一个培养瓶中收集 3 次。然后,将细胞分开培养,使细胞再次汇合

    1. 收集约 30 个受精后 8 h 的胚胎。

    2. 通过链酶蛋白酶处理,除去绒毛膜 [ Sun et al.,1995a ]。

    3. 用胰蛋白酶孵育胚胎 1 min,同时用吸管轻轻吹打,以便使细胞分散。

    4. 加入 FBS (终浓度为 10 % ) ,终止胰蛋白酶的消化。

    5. 离心(500 g ,10 min ) ,收集细胞。

    6. 用 5 ml 含有 PGF 的 LDF 原代培养液混悬细胞,然后将细胞移入 25 cm2 培养瓶。

    7. 在 26°C 条件下,让细胞贴壁和汇合。

    8. 当细胞汇合时,用同样的培养液传代。

    9. 培养 2~3 代后,上皮细胞和成纤维细胞将混合出现。这些细胞可用含有 10% FBS 的 LDF 基础培养液维持培养。通过不同的胰蛋白酶消化,为下一步培养筛选成纤维细胞。

    (a)用胰蛋白酶处理细胞 1 min 以除去大部分成纤维细胞,保留贴在瓶壁上的上皮细胞。

    (b)将成纤维细胞移入另 1 个培养瓶。当细胞汇合时,重复以上过程。

    (c)培养 2~3 代后,细胞均为成纤维细胞。

    10. 制备生长抑制的成纤维细胞饲养层:

    (a)将细胞加入合适的培养皿或培养瓶,使成纤维细胞生长成为汇合的单层。

    (b)将 10 μg/ml 丝烈霉素 C 加入成纤维细胞中,在 26°C 条件下处理 3 h。

    (c)用 LDF 浸洗 3 次后,可将生长抑制的成纤维细胞用作斑马鱼胚细胞培养的伺养层。


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