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    用[35S]蛋氨酸和[35S]半胱氨酸标记哺乳动物细胞的方法

    发布时间: 2021-11-08  点击次数: 299次
    材料与仪器

    细胞
    培养基

    实验步骤

    1. 制备活跃生长着的细胞。从单层培养细胞(约铺满 75% 表面积)中吸去培养基。用预热至 37℃ 的无血清培养基冲洗两次(培养基中应该不含蛋氨酸和半胱氨酸)。对于悬浮培养细胞,通过 400 g 离心 5 分钟收集细胞。用顶热至 37℃ 的无蛋氨酸培养基重悬沉淀,400 g 离心 5 分钟。尽可能地去掉上清,用无蛋氨酸培养基重悬细胞至 107 细胞/ml 后转移至一块小培养板。

    2. 加入预热的无蛋氨酸和半胱氨酸的培养基,于 37℃ 培养 20 分钟,以耗尽胞内含硫氨基酸库。

    3. 吸去培养基,立刻换上预热的、无蛋氨酸和半胱氨酸何含有适量标记氨基酸的新鲜培养基,依据预实验结果,将细胞于 37℃ 培养一定时间(对于末做过预实验的蛋白质,以 2~4 小时作为初始值比较合适)

    4. 移去放射性培养基。对于单层培养细胞,吸出即可。悬浮培养细胞则可转至试管,400 g 离心 5 分钟,倒去上清。

    5. 准备一块冻至 0℃ 的平板(如放在冰盒上的铝板),将单层细胞培养板放上去。用冰冷的 PBS 冲洗两次,冲洗液都到进放射性废料桶。悬浮培养细胞用 PBS 重悬,400 g 离心 5 分钟,倒去上清。

    6. 抽干细胞上残留的 PBS,裂解细胞。


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