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    背根神经节细胞的原代培养实验步骤

    发布时间: 2021-11-08  点击次数: 238次
    材料与仪器

    孵化8-12d的鸡胚。孕15d及新生1-3d的大、小鼠仔鼠
    含10%胎牛血清的DMEM培养基 神经元维持培养基(Neurobasal+B27+谷氨酰胺+20ng mlNGF) 10µM阿糖胞苷(ARA-C)
    培养瓶

    实验步骤



    获得消毒动物后详细的步骤如下:


    1.无菌条件下仰卧放置胚胎或仔鼠于冰D-PBS液中,断头后打开胸腹腔,除去内脏器官。从颈部椎管开口插入显微剪,沿脊柱背侧中线两侧剪开椎管,去除暴露脊髓后,即在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧排列的背根节,用精细显微摄小心提取,并剥除其被膜。


    2.若施行组织块培养,可用精细显微剪将每个背根节剖为2-3个植块,直接接种于涂有鼠尾胶的基质上,加少量含10%胎牛血清的DMEM培养液培养。


    3.如若需要背根神经节分散细胞培养,则可将分离好的DRG组织块收集入0.25%胰蛋白酶液中37℃消化30min。加人10滴胎牛血清终止消化后,900r/min离心5min,去除上清。而后依照总论的方法在含10%胎牛血清的DMEM培养液中制成单细胞悬液,调整细胞浓度为(0.5-1)X105/ml接种细胞于多聚赖氨酸包被的介质上,37℃,5%CO2的孵育箱内培养。


    4.以上两种培养方法24h后均倾去培养皿内种植培养液,改用无血清培养液(Neurobasal+827+谷氨酰胺+20ng/ml NGF)培养。接种第3天,加入细胞分裂抑制剂ARA-C以抑制非神经细胞的增殖,作用48h后半量更换新鲜培养液,以后每周1/2量换液2次。


    5.纯化培养的DRGs可以存活2个月之久,纯度可达96%以上。分散培养的DRG神经元48h可见胞体有光晕感,圆形或椭圆形,大小不一,有多极、双极和假单极神经元。2d后给予抑制剂处理后,DRG突起生长迅速,形成稀疏网络状结构。随着培养时间的延长,神经元突起的主干和分枝明显延长并增粗,神经突起网络变得更加致密,杂质细胞已经脱壁漂浮,培养物背景变得干净清晰很多,免疫细胞化学进一步鉴定培养细胞为神经丝(NF)阳性(图1-3)。


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