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    分离培养细胞的操作步骤

    发布时间: 2021-11-12  点击次数: 904次
    材料与仪器

    活检组织块
    Ham F12 FBS D-PBSA
    手术刀 长剪刀 Petri 培养皿 离心管 血细胞计数板

    实验步骤


    一、材料


    无菌 


    1. 转运培养液:Ham F12(Seromed 08101),不含 NaHCO3,含有 20 mmol/LHEPES(Serva 25245),75 ml


    2. 生长培养液: Ham F12, 添加 20%FBS(Gibco 011-06290),200 ml 


    3. 链霉菌蛋白酶液:0.15% 链霉菌蛋白酶(Sigma P-6911)、0.03% EDTA(Merck 8418)、20IU/ml 青霉素和 20ug/ml 链霉素(0.4%Eurobio PES300),用 Ham F12 或 D-PBSA 配制 100 ml 


    4. D-PBSA:100 ml


    5. 尼龙网:孔径为 100um


    6. 手术刀 


    7. 锋利的长剪刀 


    8. Petri 培养皿:直径为 90 mm,用于切组织块 


    9. 培养皿:25 cm2,4 个 


    10. 20 ml 离心管或一般容器,5 只 


    非灭菌 


    1. 血细胞计数板 


    二、操作步骤:


    1. 分离:用手术刀切除活检组织块上的非肌性组织,然后用 D-PBSA 浸洗。


    2. 称重前,与肌纤维平行将切除活检组织切成片,用 D-PBSA 冲洗。


    3. 将组织片平行放入 Petri 培养皿盖内,切成较薄的柱状组织块,然后切成 1 mm3小块。不要挤压组织。也可在试管内用长剪刀将组织简称小块,应避免挤压组织。


    4. 用 D-PBSA 浸洗组织块,静置后吸取上清液。


    5. 在 37℃ 条件下,用链霉菌蛋白酶液消化组织块 1 h。每 1~3 mg 组织块用 15 ml 链霉菌蛋白酶液。每间隔 10~15 min 轻轻摇晃试管。


    6. 孵育后用吸管研磨组织块。由于越来越多的细胞分离下来,培养液会逐渐变得浑浊。


    7. 让组织块沉到试管的底部,形成沉降的组织块(P1)和上清液(S1)。


    8. 用孔径为 100um 的尼龙网将 S1 滤入 20 ml 离心管。轻轻摇晃或用吸管吹打上清液,使细胞混悬。


    9. 离心(350 g,8~10 min)后,吸取上清液。


    10. 准确加入 10 ml 生长培养液,用带有橡皮吸头的吸管很轻微地混悬细胞。然后,用血细胞计数板计数细胞。


    11. 用生长培养液稀释细胞悬液,以约 1.5x104个/ml 的细胞密度将细胞接种于培养瓶。从 1 g 健康供体活检组织约获得 1~2x105 个细胞。


    12. 将 15 ml 消化液加入 P1,在 37℃ 水浴中孵育组织块 30 min,并定时摇晃。


    13. 用吸管吹打细胞悬液,使细胞分散。然后,用尼龙网过滤细胞悬液。用 20 ml 生长培养液浸洗滤网。


    14. 离心(350 g,8~10 min)后,计数细胞,按上述方法接种细胞。


    15. 将培养瓶移入湿润的培养箱,在 37℃ 和 5%CO2 的条件下培养细胞,


    安全提示
    在扔入垃圾前,应该用次氯酸盐处理剩余组织和使用过的试管、吸管、培养皿。

     

    维持培养 


    16. 接种后 24 h 很轻微地换培养液,以后每 3~4d 换液 1 次。细胞主要向着分化生长。人成肌细胞的生长分 3 期,培养后 4~6d 增殖达高峰;8d 作用排列成 行;10~12d 细胞融合形成肌管增多。然而,必须记住一些细胞可能分化较早,绝大多数细胞分化时一些细胞仍处于增殖状态。


    传代培养 


    17. 将少量 EDTA 轻轻注在细胞上面后立即吸取。


    18. 加入 0.25% 胰蛋白酶液,足以在细胞上面形成一薄层。


    19. 当细胞去附着时,加入 5~10 ml 完全生长培养液,用吸管很轻微地吹打细胞,然后离心(350 g,10 min)。


    20. 计数细胞,按一定密度种植细胞。



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