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    从成年骨骼肌分离和培养成肌细胞的方法步骤

    发布时间: 2021-11-15  点击次数: 208次

    材料与仪器

    D-PBSA
    转运培养液 生长培养液 链酶菌蛋白酶液
    尼龙网 手术刀 锋利的长剪刀 Petri培养皿 培养瓶 20ml离心管或一般容器 血细胞计数板

    步骤

    一、分离

    1. 用手术刀切除活检组织块上的非肌性组织,然后用 D-PBSA 浸洗。

    2. 称重前,与肌纤维平行将切除活检组织切成片,用冲洗。

    3. 将组织片平行放入 Petri 培养皿盖内,切成较薄的柱状组织块,然后切成 1 mm3 小块。不要挤压组织。也可在试管内用长剪刀将组织剪成小块,应避免挤压组织。

    4. 用 D-PBSA 浸洗组织块,静置后吸去上清液。

    5. 在 37°C 条件下,用链酶菌蛋白酶液(0.15 % 链酶菌蛋白酶(Sigma P-6911)、0.03% EDTA(Merck 8418)、20 IU/ml 青霉素和 20 μg/ml 链霉素(0.4% Eurobio PES3000),用 Ham F12 或 D-PBSA 配制,100ml)消化组织块 1 h。每 1~3 mg 组织块用 15 ml 链酶菌蛋白酶液。每间隔 10~15 min 轻轻摇晃试管。

    6. 孵育后用吸管研磨组织块。由于越来越多的细胞分离下来,培养液会逐渐变得浑浊。

    7. 让组织块沉到试管的底部,形成沉降的组织块(P1 ) 和上清液(S1)。

    8. 用孔径为 100 μm 的尼龙网将 S1 滤入 20 ml 离心管。轻轻摇晃或用吸管吹打上清液,使细胞混悬。

    9. 离心(350 g,8~10 min)后,吸去上清液。

    10. 准确加入 10 ml 生长培养液(Ham F12,添加 20 % FBS (Gibco 011-06290),200 ml),用带有橡皮吸头的吸管很轻微地混悬细胞。然后,用血细胞计数板计数细胞。

    11. 用生长培养液稀释细胞悬液,以约 1.5×104 个/ml 的细胞密度将细胞接种于培养瓶。从 1 g 健康供体活检组织约获得 1~2×105个细胞。

    12. 将 15 ml 消化液加入 P1,在 37°C 水浴中孵育组织块 30 min,并定时摇晃。

    13. 用吸管吹打细胞悬液,使细胞分散。然后,用尼龙网过滤细胞悬液。用 20 ml 生长培养液浸洗滤网。

    14. 离心(350 g,8~10 min)后,计数细胞,按上述方法接种细胞。

    15. 将培养瓶移入湿润的培养箱,在 37°C 和 5 % CO2 的条件下培养细胞。

    二、维持培养

    16. 接种后 24 h 很轻微地换培养液,以后每 3~4 d 换液 1 次。细胞主要向着分化生长。人成肌细胞的生长分 3 期,培养后 4~6 d 增殖达髙峰;8 d 左右排列成行;10~12 d 细胞融合和形成肌管增多。然而,必须记住一些细胞可能分化较早,绝大多数细胞分化时一些细胞仍处于增殖状态。

    三、传代培养

    17. 将少量 EDTA 轻轻注在细胞上面后立即吸去。

    18. 加入 0.25 % 胰蛋白酶液,足以在细胞上面形成一薄层。

    19. 当细胞去附着时,加入 5~10 ml 完全生长培养液,用吸管很轻微地吹打细胞,然后离心(350 g,10 min)。

    20. 计数细胞,按一定密度种植细胞。


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