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    从骨骼肌分离和培养单肌纤维的方法步骤

    发布时间: 2021-11-15  点击次数: 391次

    材料与仪器

    Matrigel DMEM L-谷氨酰胺 Ⅰ型胶原蛋白
    青霉素和链霉素混合液 鸡胚提取液 马血清 胎牛血清 接种培养液 增殖培养液
    Petri培养皿 改良Pasteur吸管 24孔培养板 钻石笔 透照立体解剖显微镜

    步骤

    1. 处死动物后立即切除肌肉。注意夹持肌腱,以减少对肌纤维的损伤。

    2. 将肌肉放入 0.2 % Ⅰ型胶原蛋白酶液(W / V,用 DMEM 配制),在 35°C 条件下用摇动水浴箱孵育 60~90 min。较大肌肉需要较长消化时间,一般情况下取自 6~8 周大鼠的趾长伸肌需消化 60 min 。

    3. 准备盛肌纤维的 Petri 培养皿,即用马血清浸洗培养皿,以免肌纤维黏附于培养皿底壁上。然后,加入 20 ml DMEM。

    4. 消化后将肌肉移入盛有 DMEM 的 Petri 培养皿。

    5. 在透照立体解剖显微镜下,用改良 Pasteur 吸管(将 Pasteur 吸管割断,用钻石笔将开口弄大。然后,用火使锯齿状边缘变光滑,以免损伤肌纤维)研磨肌肉,使单肌纤维分散。

    用 10 % 马血清(用 DMEM 配制)浸蘸吸管,以免肌纤维黏附吸管。

    6. 肌纤维被分散时,肌肉的直径变小。逐渐用口径小的 Pasteur 吸管。

    7. 当分离 20~30 条肌纤维时,将肌肉移入另一 Petri 培养皿,继续分离,直至分离得到足够的肌纤维。

    8. 较大肌肉需要第二次消化,以分散位于中央处的肌纤维。表浅的肌纤维被分离后,将剩余的肌肉放人胶原蛋白酶液,进一步消化。

    9. 将肌纤维放入涂有 Matrigel (1 mg/ml,用 DMEM 配制)的培养皿。

    (a)将单肌纤维放于培养皿中央,让其贴于 Matrigel。为了培养纯单肌纤维,只放入未损伤的肌纤维,除去较皱缩部分。这些部分可能有污染的附着细胞,多为微血管段;

    (b)慢慢加入接种培养液(DMEM,添加 10% 马血清、0.5% 鸡胚提取液、4 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素),注意勿移动接种的肌纤维。

    10. 将培养皿放入培养箱,在 37°C 和 5 % CO2 条件下培养。

    增殖

    培养 12~24 h 后,卫星细胞开始从肌纤维迁出。至 3~4 天,每条肌纤维周围有 50~300 个卫星细胞。确切细胞数取决于肌纤维来源的肌肉和小鼠周龄等多种因素 [ Bockhold et al.,1998 ] 。

    11. 许多卫星细胞从肌纤维迁出时,用 Pasteur 吸管将肌纤维吸出。应在火焰上将吸管尖部拉细。

    12. 继续培养剩余的细胞。

    13. 如果需要,可传代培养,用增殖培养液(DMEM,添加 20% FBS、10% 马血清、1% 鸡胚提取液、4 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素)接种细胞。


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