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    从大鼠肝脏制备微体的方法

    发布时间: 2021-11-16  点击次数: 175次

    材料与仪器

    雄大鼠
    蔗糖 蔗糖 HM
    玻璃板

    步骤

    1. 用断颈法杀死约 150 g 重的雄大鼠,大鼠的数量取决于要制备的粗微体的数量。由于一个 150 g 重的大鼠肝(6 g)大约每克肝蛋白含有 10 mg 粗微体,所以大鼠的数量可以以回收率为 50% 来进行估计。

    2. 流干血液后,打开腹部和胸腔,切取肝,将它们放在盛有冰冷匀浆介质的烧杯中:

    匀浆介质(HM):

    0.5 mol/L 蔗糖

    1 mmol/L DTT

    3. 用冰冷 HM 冲洗大鼠肝,将它们放在纸巾上,如果有结缔组织去掉之,迅速称重。

    4. 将肝放在干净的玻璃板上,用剃须刀片将其切成尽可能小的碎片,直到形成浆糊样稠状物。当肝在小烧杯里用剪刀剪碎时,不加HM 要容易些,因为 HM 妨碍剪切。

    5. 将切碎的肝放入盛有 4~5 倍体积冰冷 HM 的烧杯中,轻轻混旋,等碎片沉到底部后去掉液体以去除血液。

    6. 4 倍体积的 HM 在配套宽松的 Dounce 匀浆器(带两个研杵的 40 ml Dounce 匀浆器)中轻轻杵击 5~10 次(上下各一次为一次杵击),或者在 Potter-Elvdijem 玻璃/Teflon 匀浆器(0.04~0.06 英寸清除率;Kontes)中用马达带动的 Teflon 研杵以 1700 r/min 的速率匀浆(5~10 次杵击),将匀浆物保持在冰水里。

    7. 将匀浆物经过 4~6 层用 HM 预先湿润过的干酪纱布过滤到刻度量筒中。过滤结束后,将沙布的边沿合到一块,慢慢地从口部到底部挤压袋子。

    8. 将匀浆物体积增加到肝重量的 5 倍,用石蜡封口膜盖注,倒转量筒数次以混匀勻浆物。

    9. 在 Sorvall 低温冷冻离心机的 SS34 转头中 2500 r/min 离心匀浆物 5 分钟,然后提高速度到 15000 r/min(最大 23000 g)离心 15 分钟。

    10. 用纸巾、吸管或注射器和金属针头将表面的一层白色东西吸去,然后用注射器和金属针头将上清(PMS ) 转移到刻度量筒中。

    11. 用 PMS 和 2.5 mol/L 蔗糖制备三种蔗糖溶液。

    (1) 1.35 mol/L 含 PMS 的蔗糖(用 1 体积的 PMS 和 0.7 体积的 2.5 mol/L 蔗糖混合制备)

    (2) 1.55 mol/L 含 PMS 的蔗糖(用 1 体积的 PMS 和 1.1 体积的 2.5 mol/L 蔗糖混合制备)

    (3) 1.8 mol/L 含 PMS 的蔗糖(用 1 体积的 PMS 和 2 体积的 2.5 mol/L 蔗糖混合制备)

    12. 用第 11 步制备的溶液在 Ti60 转头(Beckmanlnslrmnents) 的超离心管中制备分级梯度。自上而下铺上 5 ml 1.8 mol/L 蔗糖-PMS、3 ml 1.55 mol/L 蔗糖-PMS、15~17 ml 1.35 mol/L蔗糖-PMS,最后是 2~3 ml 1 mol/L 蔗糖溶液。

    13. 4℃ 48000 r/min(最大 240000 g)离心至少 6 小时。

    14. 用注射器和金属针头收集沉降在 1.55 mol/L 蔗糖溶液的两条带或一条弥散带中的膜结构,这就是粗微体部分,可以用于以后的各种目的。

    15. 制备 TKM 缓冲液和高速离心上清(HSS)

    (1) 制备 TKM 缓冲液

    ① TKM 缓冲液

    50 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5)

    50 mmol/L KCl

    5 mmol/L MgCl2

    ② TK20M 缓冲液

    50 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5

    50 mmol/L KCl

    20 mmol/L MgCl2

    (2) 用 2 倍体积 0.25 mol/L 蔗糖-3 mmol/L DTT 或 0.25 mol/L 蔗糖-TKM- 3 mmol/L DTT 溶液匀浆切碎的肝。

    (3) 15000 r/min 离心匀浆物 15 分钟,取出并保存上清。

    (4) 上清在 Ti60 转头中 4℃ 45000 r/min ( 最大 200000 g ) 离心 60 分钟。

    (5) 取出并去掉最上面的脂肪层,从上面取出 4/5 的液体作为内源性 RNase 抑制剂(HSS),分装并保存在 -70℃。

    (6) 如果要进行体外翻译,用 G100 凝胶层析柱从大鼠肝 HSS 中制备 G100 部分。

    16. 按下列方法处理粗微体部分。

    (1) 制备膜结合多聚核糖体

    ① 用含 HSS ( 20% v/v) 的 TK20M 将粗微体部分稀释 3 倍,与 Triton X-100 和 DOC ( 终浓度分别为 1% 和 0.5% ) 混合,放冰上 10 分钟。

    ② 将混合物铺在制备于 Ti60 转头离心管中的分级梯度上,该梯度(自下而上)含有 5 ml 2.0 mol/L 含有 HSS (10% v/v) 或人胎盘核糖核酸酶抑制剂 ( 2~4 U/ml ) 的蔗糖-TK20M 溶液、3 ml 1.55 mol/L 含有 HSS (10% v/v) 的蔗糖-TK20M 溶液和 15~18 ml 去污剂处理的粗微体部分。

    ③ 4℃ 44000 r/min ( 最大 200000 g)离心梯度 14~16 小时。

    ④ 将上清倒掉,立即用 3~5 ml TKM 冲洗离心管的内管壁(将缓冲液加到管壁上而不要直接加到多聚核糖体沉淀上,轻轻混旋并弃掉上清)。将离心管倒立在干净纸巾上数分钟,用 Kimwipe 纸巾轻察内管壁,保存在 -70℃ 待用。

    (2) 用粗微体进行体外 35S 甲硫氨酸掺入

    ① 要浓缩粗微体,用含 HSS ( 10% v/v) 的 TKM 稀释粗微体 4 倍,在 SW41 转头的离心管里准备(自下而上)含有 1 ml 含 HSS 的 1.8 mol/L 蔗糖-TKM,1 ml 含 G100 部分的(20% v/v ) 的 1.3 mol/L 蔗糖-TKM 和 2 ml 含 HSS (10% v/v ) 的 0.7 mol/L 蔗糖-TKM 的梯度,在该梯度上铺 8 ml 稀释的粗微体。

    ② 4℃ 35000 r/min ( 最大 210000 g)离心梯度 60 分钟。

    ③ 收集在 1.8 mol/L 和 1.3 mol/L 蔗糖界面之间形成的条带,体积要尽可能小以免降低微体的浓度,立即用于 G100 系统的翻译(Gaetani et at.1983)。

    (3) 对于不要求完整的膜结合多聚核糖体的实验

    ① 用 TKM 稀释粗微体 3 倍,在 Ti60 转头中 4℃ 40000 r/min ( 最大 160000 g)离心 60 分钟。

    ② 倒掉上清,将管子立于一叠纸巾上数分钟,用 Kimwipe 纸巾轻擦内壁,保存于 -70℃ 待用。


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