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    从狗的胰脏中制备粗微体

    发布时间: 2021-11-17  点击次数: 156次

    材料与仪器

    胰脏
    HM 缓冲液 蔗糖-缓冲液 三乙基氨基乙酸缓冲液

    步骤

    1. 从动物身体切下胰脏,立即用大约 50 ml 冷 HM 缓冲液冲洗,放置于干净的纸巾上,去除结缔组织:

    匀浆介质(HM)

    0.25 mol/L 蔗糖-缓冲液A

    缓冲液A:

    50 mmol/L 三乙基氨基乙酸缓冲液(TEA),pH 7.5

    50 mmol/L KOAc

    6 mmol/L Mg (0Ac)2

    1 mmol/L EDTA

    0.5 mmol/L PMSF

    贮存液:   

    1 mol/L 三乙醇氨缓冲液,pH 7.5

    4 mol/L KOAc,pH 7.5

    1 mol/L Mg (OAc)2

    PMSF:100 mmol/L 溶于 DMSO

    2. 称量胰脏的重量,置于干净的玻璃盘里,用剃须刀片将其切成尽可能小的碎片。

    3. 将切碎的胰脏过组织压碎器并在 4 倍体积的 HM 中用马达带动的 Potter-Elvehjem Teflon 匀浆器匀浆,将匀浆器的管子保持在冰水中。

    4. 用 Sorvall HB-4 转头或 SS34 转头在 Sorvall 冷冻离心机(DuPont Instrumcm) (最大 1000 g)中 4℃ 3200 r/min 离心 10 分钟以去除细胞核、一些线粒体和未破碎的细胞。

    5. 在同样的转头(平均 10000 g)中 4℃ 10000 r/min 离心上清(后细胞核上清)10 分钟以去除线粒体和溶酶体。

    6. 用注射器和针头将上清(后线粒体上清或 PMS ) 小心转移,避免取疏松的那一层。

    7. 在 Ti60 转头的离心管中铺 18 ml PMS 于 6 ml 1.3 mol/L 蔗糖-缓冲液A ( PMS 与垫层的比例大约为 3:1)上,44000 r/min ( 最大 200000 g)离心 2.5 小时。

    8. 用吸管去掉上清,包栝垫层溶液、界面的膜物质和疏松层。

    9. 用 Kimwipe 纸巾轻擦离心管的内壁,用 Dounce 匀浆器通过 2 到 3 次上下杵击将沉淀重悬于小体积的 0.25 mol/L 蔗糖-缓冲液 B中(1 g 组织中提取的微体约用 0.5 ml 缓冲液)。

    缓冲液 B:

    50 mmol/L TEA

    1 mmol/L EDTA

    10. 取 10 μl 与 1 ml 0.1% SDS 溶液混合,测定 260 nm 和 280 nm 的光吸收值,用同样的缓冲液将微体的浓度调节到 50 A280 nm/A280 nm 的值约为 1.9。从 1 g 组织中大约获得 50 A280 nm 单位的粗微体。

    11. 分装粗微体悬浮液,在液氮中冷冻并保存在 -70℃。

    12. 进一步用 EDTA 处理粗微体以增加转运活性,用凝胶过滤来减少微体在麦胚翻译系统中的抑制作用,或用核酸酶来降低本底。 EDTA 的处理是这样的:

    (1) 将粗微体与等体积的 0.25 mol/L 蔗糖、50 mmol/L TEA 和 50 mmol/L EDTA 溶液混合。

    (2) 将化合物 0℃ 保温 15 分钟。

    (3) 在含有 0.5 mol/L 蔗糖、50 mmol/L TEA 溶液的 Ti60 离心管中铺上保温过的样品(样品与垫层的比例大约为 3:1),44000 r/min ( 最大 200000 g ) 离心 60 分钟。

    (4) 用吸管或注射器取出上清,用干净的 Kimwipe 纸巾轻擦离心管内壁。

    (5) 用与起始粗微体体积相等的 0.25 mol/L 蔗糖、50 mmol/L TEA 和 1 mmol/L DTT 溶液重悬沉淀,用 Dounce 匀浆器轻轻匀浆。分装悬浮液,在液氮中冷冻并保存在 -70℃。


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