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    如何从组织中分离制备细胞核基质/中间纤维支架结构?

    发布时间: 2021-11-18  点击次数: 136次

    材料与仪器

    新鲜组织
    NaCl 缓冲液 细胞骨架缓冲液
    Teflon 研杵 Doume 匀浆器

    步骤

    1. 在 4℃ 将新鲜组织切成 1 mm3 左右的小块。在 4℃,用 Teflon 研杵和 Doume 匀浆器在含 0.5% Tritron X-100 的细胞骨架缓冲液中对切碎的组织进行匀浆,直到没有可见的团块。每克组织用大约 10 ml 缓冲液。

    含 0.5% Triton X-100 的细胞骨架缓冲液:

    10 mmol/L PIPES,pH 6.8

    300 mmoI/L 蔗糖

    100 mmoI/L NaCI

    3 mmol/L MgCl2

    1 mmol/L EGTA

    2. 用一 250 μm 孔径的尼龙滤器过滤匀浆。基质成分和没有充分匀浆的团块将留在滤器上。

    3. 在 4℃ 用抽提缓冲液抽提 3~5 分钟。

    抽提缓冲液:

    10 mmol/L PIPES,pH 6.8

    250 mmol/L 硫酸铵

    300 mmol/L 蔗糖

    3 mmol/L MgCl2

    1 mmol/L EGTA

    4. 在含 0.5% Triion X-I00 的消化缓冲液中用无 RNA 酶的 DNA 酶消化以去除染色质 DNA 酶浓度为 200~400 单位/ml,32℃ 反应 30~50 分钟。

    含 0.5 % Triton X-100 的消化缓冲液:

    10 mmol/L PIPES,pH 6.8

    300 mmol/L 蔗糖

    50 mmol/L NaCl

    3 mmol/L MgCl2

    1 mmol/L EGTA

    5. 用抽提缓冲液清洗样品 5 分钟。

    6. (可选)样品在 4℃ 用 2 mol/L NaCl 抽提 3~5 分钟。这一步能使可能形成核基质核心的 10 nm纤丝分支显形(Jackson and Cook 1988; He et al, 1990)。在第 4 步中用 Hae Ⅲ 和 Pst Ⅰ(每种酶400 单位/ml)代替 DNA 酶 Ⅰ 可以使核心纤丝保存的更好。

    2 mol/L NaCl 缓冲液:

    10 mmol/L PIPES,pH 6.8

    300 mmol/L 蔗糖

    2 mol/L NaCl

    3 mmol/L MgCl2

    1 mmol/L EGTA

    7. 固定核基质以进行免疫荧光检测或电子显微镜检测。


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