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    如何从培养细胞中制备细胞核基质/中间纤维骨架结构?

    发布时间: 2021-11-18  点击次数: 144次

    材料与仪器

    细胞
    Tritron X-100 抽提缓冲液
    电子显微镜

    步骤

    1. 在 4℃ 用 PBS 洗细胞一次。

    2. 在 4℃ 用含 0.5% Tritron X-100 的细胞骨架缓冲液抽提细胞 3 到 5 分钟。直到消化步骤,每 107 个细胞最少要用 1 ml 缓冲液,以后减半。

    3. 在 4℃ 用抽提缓冲液抽提细胞 3~5 分钟。这一步去除组蛋白 H1 和除中间纤维蛋白之外的细胞骨架蛋白。另外,这一步也可在 DNA 酶消化步骤(第 4 步)之后作,这样也不会引起超微结构的变化。

    抽提缓冲液:

    10 mmol/L PIPES,pH 6.8

    250 mmol/L 硫酸铵

    300 mmol/L 蔗糖

    3 mmol/L MgCl2

    1 mmol/L EDTA

    4. 在含 0.5% Triton X-100 的消化缓冲液中用无 RNA 酶的 DNA 酶消化以去除染色质 DNA 酶浓度为 200~400 单位/ml,32℃ 反应 30~50 分钟。

    含 0.5% Triton X-100 的消化缓冲液:

    10 mmol/L PIPES,pH 6.8

    300 mmol/L 蔗糖

    50 mmol/L NaCl

    3 mmol/L MgCl2

    1 mmol/L EGTA

    5. 用抽提缓冲液清洗样品两次,每次 5 分钟。

    6. (可选)样品在 4℃ 用 2 mol/L NaCl 抽提 3~5 分钟。这一步能使可能形成核基质核心的 10 nm 纤丝分支显形(Jackson and Cook 1988; He et al, 1990)。在第 4 步中用 Hae Ⅲ 和 Pst Ⅰ(每种酶 400 单位/ml)代替 DNA 酶 Ⅰ 可以使核心纤丝保存的更好。

    2 mol/L NaCl 缓冲液:

    10 mmol/L PIPES,pH 6.8

    300 mmol/L 蔗糖

    2 mol/L NaCl

    3 mmol/L MgCl2

    1 mmol/L EGTA

    7. 固定核基质以进行免疫荧光检测或电子显微镜检测。


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