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    基因组DNA的快速纯化方法

    发布时间: 2021-11-18  点击次数: 196次

    材料与仪器

    尾部缓冲液 蛋白酶 K
    离心管 玻璃棒

    步骤

    第 1 天

    1. 大约 1.5 cm 长的尾部活检样品放在一个 1.5 ml 盛有 0.7 ml 尾部缓冲液的小离心管中,加 35 ul 10 mg/ml 蛋白酶 K,在 55℃ 振摇温育过夜。

    尾部缓冲液(配 25 ml)

    50 mmol/L Tris,pH 8                           1.25 ml 1 mol/L Tris,pH 8

    100 mmol/L EDTA,pH8                        5 ml 0.5 mol/L EDTA,pH 8

    100 mmol/L NaCI                                  0.5 ml 5 mol/L NaCI

    1% SDS                                              1.25 ml 20% SDS

    存放于室温。

    蛋白酶 K:10 mg/ml 水溶液,贮存于 -20℃。

    第 2 天

    2. 加 7 ul 10 mg/ml RNA 酶(不含 DNA 酶),在 37℃ 孵育 1~2 小时。

    3. 在微量离心机中对样品离心 20 分钟以沉淀鼠毛。

    4. 小心转移 0.5 ml 上清,注意不要搅动沉淀。

    5. 在管子中加 0.5 ml 异丙醇并通过翻转轻轻地进行混合。应该立即有线状沉淀形成。

    不要剧烈混合。不要使 DNA 形成紧密团块,否则会难以绕缠。

    6. 在 Bunsen 灯的火焰上加热封闭 100 ul 玻璃小吸管的末端。

    7. 把末端封闭的小吸管浸到 DNA 溶液中并剧烈搅拌来缠绕 DNA。一直搅动吸管直到 DNA 紧紧地缠绕到上面。

    8. 洗 DNA 是在三个顺序排列的盛大约 50 ml 乙醇的烧杯中各浸 10 次(1 个是 70% 乙醇,另 2 个是 100% 乙醇)。洗 5~8 个样品后换洗涤溶液。

    9. 用一片胶带标记玻棒末端,把它插在(DNA 端朝上)一块橡皮泥,使风干 10~15 分钟。

    10. 用钻石记号笔在黏附了 DNA 的那一末端刻线,弄断玻棒,把带 DNA 的那段放到已作标记的微量离心管中。

    11. 加 0.5 ml TE ( pH 8 )。样品在室温下振荡过夜。

    第 3 天

    12. 稍稍振荡管子,用干净镊子拿掉玻璃棒(在不同样品的操作之间烧一下镊子): 继续振摇 1~2 小时。(如果样品只是用来进行 PCR 分析,玻棒可以留在管子里)。

    13. 以 1:10 稀释样品,测 OD260 值以确定浓度(1 OD260=50 ug/ml).

    14. DNA 贮存在 4℃。


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