销售热线

19126518388
  • 技术文章ARTICLE

    您当前的位置:首页 > 技术文章 > 纯化质粒(碱裂解法)

    纯化质粒(碱裂解法)

    发布时间: 2021-11-18  点击次数: 236次

    材料与仪器

    大肠杆菌
    LB 葡萄糖缓冲液 乙酸钾
    离心管

    步骤

    1. 单个大肠杆菌克隆接种到 2 ml 含适当抗生素的 LB 中。37℃ 剧烈振荡孵育 5~8 小时。或者可以培养过夜使饱和。

    2. 倒 1.5 ml 培养液到已作标记的微量离心管中。把剩下的培养液存放在 4℃。

    3. 在微量离心机上离心 2 分钟以沉淀大肠杆菌。吸掉培养液。

    4. 用 100 ul 葡萄糖缓冲液重悬沉淀物。在室温孵育 5 分钟。在这时候充分悬浮大肠杆菌对于获得尽可能大的产量是很重要的。

    葡萄糖缓冲液(配 500 ml)

    50 mmol/L 葡萄糖                    4.5 g 葡萄糖

    10 mmol/L EDTA,pH 8.0       10 ml 0.5 mol/L EDTA,pH 8.0

    25 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0   12.5 ml 1.0 mol/L Tris-HCl,pH 8.0

    过滤除菌,贮存在 4℃。

    5. 在管中加 200 ul NaOH-SDS 溶液,轻轻地颠倒混合。冰浴 5 分钟。溶液应该明显变清了,但仍然非常黏。

    NaOH-SDS 溶液(配 50 ml)

    0.2 mol/L NaOH               0.4 g NaOH

    1% SDS                           2.5 ml 20%  (w/v)  SDS

    可在室温存放 2~3 周。

    6. 每个管中加 150 ul 冷的 3 mol/L 乙酸钾,pH 5.2,颠倒混合;冰浴 5 分钟,会形成白色絮状沉淀。

    3 mol/L 乙酸钾:

    5 moI/L 乙酸钾          60 ml

    冰乙酸                      11.5 ml

    加水到 100 ml。贮存在 4℃。

    7. 在小离心机上离心 5 分钟,然后转移 400 ul 上清到一个已作标记的管中。

    8. 管中加 0.5 ml 酸/氯仿/异戊醇(50:49:1) 溶液,振摇,在离心机上离心 5 分钟。

    酚/氯仿/异戊醇(50:49:1)

    50% TE 饱和酚

    49% 氯仿

    1% 异戊醇

    避光贮存于 4℃。

    9. 小心地把水相(上层)转移到已作标记的管中。

    10. 加 1.0 ml 100% 乙醇,混合,然后离心 5 分钟沉淀 DNA。

    11. 去掉上清。应该能看到一个小的白色沉淀物。加 1.0 mI 70% 乙醇洗涤沉淀物,并离心 5 分钟。

    12. 去掉上清。管子离心 5 秒钟使残余液体流到管底。吸掉液体,让乙醇挥发 5~10 分钟。(或者可以真空干燥管子。)

    13. 用 25~50 ul 的 TE(pH 8.0)重悬沉淀物。质粒 DNA 应该很容易溶解。不易溶解的物质很可能不是 DNA。

    14. 在这 32 uI DNA 溶液中加 8.0 ul 4 mol/L NaCl 和 40 ul 113% (w/v) PEG8000。混合均匀并冰浴 1 小时或更长时间。

    15. 用小离心机在 4℃ 离心 15 分钟以沉淀 DNA。

    16. 小心去掉上清并加 1.0 ml 70% 乙醇洗涤沉淀物,离心 5 分钟。

    17. 小心去掉乙醇,离心 5 秒钟使残余液体流到管底。吸掉液体并让乙醇挥发 5~10 分钟。

    18. 根据测序方法的要求用 20~30 ul TE 或水重悬沉淀物。


在线咨询
咨询热线

0759-5588931

[关闭]