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    如何做核提取物制备优化?

    发布时间: 2021-11-24  点击次数: 184次

    材料与仪器

    转瓶或单层培养的哺乳动物细胞(如HeLa细胞)
    高盐缓冲液 分别含 0.8、1.0、1.2、1.4 及 1.6 mol L KCl
    贝克曼 JS4. 2 转子或相当的转子 50 mL 圆锥形刻度聚丙烯离心管(对较小体积的提取物也可用 15 mL 的离心管) Dounce 氏玻璃匀浆器(B 型研杵) Beckman JA-20 离心转子或相当的转子磁性搅拌器或倾斜台 管型透析膜(14000 MWCO) 电导计

    步骤


    1)按基本方案中步骤1〜8操作。


    2)在低盐缓冲液中重悬细胞核后(1/2体积pnv,见基本方案步骤8),将细胞核悬液分成5等份。


    3)在冷室内不断搅拌,按如下方法在每份悬液中加入1/3体积高盐缓冲液:在第1份 中加KCl浓度低至(0.8 mol/L)的高盐缓冲液,其余各份中依次加入KCl浓度逐 渐增高(直到1. 6 mol/L)的高盐缓冲液。


    4)确定在离心管斜面上有提取出的细胞核,轻轻混合30 min。


    5)25000 g离心30 min,除掉核。


    6)将上清轻轻倒出,进行透析(见基本方案步骤12),直到加KCl浓度最高的那份核悬液的电导率达到与透析液一致(100 mmol/L KCl)。提取物25000 g离心20 min。


    7)检测各份提取物的电导率并测定蛋白质浓度(见基本方案步骤13和14)。


    8)直接分析提取物或分装到试管中,在液氮中速冷后放入-80℃保存。



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