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如何做核提取物制备优化？
发布时间： 2021-11-24 点击次数： 733次材料与仪器
转瓶或单层培养的哺乳动物细胞（如HeLa细胞）
高盐缓冲液 分别含 0.8、1.0、1.2、1.4 及 1.6 mol L KCl
贝克曼 JS4. 2 转子或相当的转子 50 mL 圆锥形刻度聚丙烯离心管（对较小体积的提取物也可用 15 mL 的离心管） Dounce 氏玻璃匀浆器（B 型研杵） Beckman JA-20 离心转子或相当的转子磁性搅拌器或倾斜台 管型透析膜（14000 MWCO） 电导计步骤
1)按基本方案中步骤1〜8操作。
2)在低盐缓冲液中重悬细胞核后（1/2体积pnv，见基本方案步骤8)，将细胞核悬液分成5等份。
3)在冷室内不断搅拌，按如下方法在每份悬液中加入1/3体积高盐缓冲液：在第1份 中加KCl浓度低至（0.8 mol/L)的高盐缓冲液，其余各份中依次加入KCl浓度逐 渐增高（直到1. 6 mol/L)的高盐缓冲液。
4)确定在离心管斜面上有提取出的细胞核，轻轻混合30 min。
5)25000 g离心30 min,除掉核。
6)将上清轻轻倒出，进行透析（见基本方案步骤12)，直到加KCl浓度最高的那份核悬液的电导率达到与透析液一致（100 mmol/L KCl)。提取物25000 g离心20 min。
7)检测各份提取物的电导率并测定蛋白质浓度（见基本方案步骤13和14)。
8)直接分析提取物或分装到试管中，在液氮中速冷后放入-80℃保存。
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