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    核提取物的制备方法

    发布时间: 2021-11-24  点击次数: 361次

    材料与仪器

    转瓶或单层培养的哺乳动物细胞(如HeLa细胞)
    PBS 低渗缓冲液 高盐缓冲液 含1. 2 mol L KCl 透析缓冲液 液氮
    贝克曼 JS4. 2 转子或相当的转子 50 mL 圆锥形刻度聚丙烯离心管(对较小体积的提取物也可用 15 mL 的离心管) Dounce 氏玻璃匀浆器(B 型研杵) Beckman JA-20 离心转子或相当的转子磁性搅拌器或倾斜台 Beckman JA-20 离心转子或相当的转子磁性搅拌器或倾斜台、 管型透析膜(14000 MWCO)、电导计

    步骤


    1a) 收集转瓶培养的细胞:将 5× 108〜10× 108 细胞置 1 L 的塑料瓶 1850 g 离心 20 min。轻轻倒去上清并丢弃,将细胞转入50 mL 锥形刻度离心管中(每管 2〜3 L 培养液中的细胞)。进行步骤 2。


    1b) 收集单层培养的细胞:单层细胞长满后去掉培养液。用足量 PBS 洗 1 次,PBS 用 量为没过细胞,轻轻振荡,弃 PBS。将细胞刮入新鲜 PBS 液里,倒进锥形刻度离心管中。进行步骤 2。


    2) 1850 g 离心 10 min。进行步骤 3a 转瓶培养或步骤 3b 单层培养。


    3a) 转瓶培养细胞:轻轻倒出上清并弃掉。用离心管上的刻度测量压紧后细胞的体积 (Pcv)将细胞重悬于约 5 倍于其 pcv 的 PBS 液中。1850 g 离心10 min。进行步 骤 4。


    3b) 单层培养细胞:轻轻倒出上清并弃掉。用离心管上的刻度测量 pcv, 进行步骤 4。


    4) 快速地将沉淀的细胞重悬于 5 倍体积的低渗缓冲液中1850 g 离心 10 min 并弃掉上 清。


    5) 将细胞沉淀重悬于 3 倍于原 pcv 的低渗缓冲液中,放置在冰上 10 min,让细胞肿胀。


    6) 将细胞转到 Dmmce 氏玻璃匀浆器中,用 B 号研杵上下抽提 10 次。用台盼蓝染色排斥法在显微镜下检査细胞裂解情况(应大于80%〜90%)。


    7) 将细胞转到离心管中。用 JS4.2 转子 3300 g 离心 15 min 收集细胞核。保留上清用来制备 S-l00 细胞质提取物。


    8) 用离心管上的刻度测量第 7 步离心压紧后的细胞核体积(pnv)。用 l/2 pnv 体积的低盐缓冲液重悬细胞核。


    9) 在轻轻搅拌的同时,逐滴加入1/2 pnv 体积(见步骤 8) 的高盐缓冲液。必要时用 Dounce 氏玻璃匀装器混匀。


    10) 不断轻轻搅拌 30 min 以提取核内容物。


    11) 用 Beckman JA-20 转子 25 000 g 离心 30 min 以收集核提取物。倒出上清并测量其电导率(见步骤 12),这就是核提取物。


    12) 将核提取物加入透析管中,用夹子至少封住透析袋的一端;透析袋一端是打开的, 这样就可以测量透析袋内核提取物的电导率,比较核提取物电导率和透析液电导率 的不同,以确定是否需要进一步透析。在 50 倍体积的透析液中进行透析,直到提 取物的电导率和透析液一致为止(即提取物的 KCr 浓度达到 100 mmol/L 时)。尽量缩短透析时间。


    取 5〜10 μl 提取物用水稀释至 1 mL 用来测电导。用电导测量仪直接读出稀释液的电导值,与同样稀释的透析液的电导值相比较。


    13) 将提取物从透析袋中移出,最后一次检测其电导率以确定透析已经完成。将提取物25000 g 离心 20 min, 弃掉沉淀。


    14) 测定上清中蛋白质浓度。根据需要分装,浸入液氮中速冻,-80℃保存。



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