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    关于细胞转染实验,这几点必须要清楚

    发布时间: 2021-11-25  点击次数: 315次

    细胞转染是指将外源分子如 DNA RNA 等导入真核细胞的技术。可分为瞬时转染,稳定转染

        瞬时转染是指外源 DNA/RNA 不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其他调控元件的分析。一般来说,超螺旋质粒 DNA 转染效率较高,在转染后 24-72 h 内分析结果,常常用到一些报告系统如荧光蛋白,β半乳糖苷酶等来帮助检测。

        稳定转染是指外源 DNA 既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体存在。尽管线性 DNA 比超螺旋 DNA 转入量低但整合率高。外源 DNA 整合到染色体中概率很小,通常需要一些选择性标记反复筛选得到稳定转染的同源细胞系。


    主要有下面几种方法:

    化学法:磷酸钙法、DEAE-右旋糖苷法、阳离子脂质体法;物理法:电穿孔法、显微注射法、biolistic 颗粒传递法;病毒介导法:逆转录病毒、腺病毒

    A. 阳离子脂质体法:

        带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞。过程如下图:

    图片

       特点:

        简单通用,适用性广,转染效率高,重复性好,但转染时需除血清,转染效率随细胞类型变化大。由于脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会远大于悬浮细胞,所以贴壁比悬浮转染效率要高。悬浮细胞建议使用电穿孔法。

    B. 电穿孔法:

        利用高压电脉冲对细胞膜的干扰,使其形成利于核酸进入的微孔。

    C. 逆转录病毒(RNA):

        通过病毒中膜糖蛋白和宿主细胞表面的受体相互作用进入宿主细胞,之后反转录酶启动合成 DNA 并随机整合到宿主基因组中。

        特点:稳定转染,可用于难转染的细胞、原代细胞,体内细胞等,但携带基因不能太大。

    D. 腺病毒(双链 DNA):

        先和细胞表面的受体结合,继而在αV 整合素介导下被细胞内吞。

        特点:可用于难转染的细胞。

    图片


        影响转染的因素:

        血清 血清影响复合物的形成,降低转染效率

        阳离子脂质体和 DNA 的最佳量在使用血清时会有所不同,因此想在转染培养基中加入血清时要进行条件优化。大部分细胞可以在无血清培养基中几个小时内保持健康,对于对血清缺乏比较敏感的细胞,可以使用 OPTI-MEM I 培养基。对于对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞,建议使用 LIPOFECTAMINE 2000。

        抗生素

        比如青霉素和链霉素,是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒,但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性,使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性,导致转染效率低。

        细胞代数

        转染前细胞最好经过 1-2 次传代保证细胞生长旺盛容易转染,注意贴壁细胞一旦长满就不好转染。

        细胞铺板密度

        一般转染时,贴壁细胞密度为 70%-90%,悬浮细胞密度为 2*10^6--4*10^6 细胞/ml 时效果较好。确保转染时细胞没有长满或处于静止期。铺板细胞数目的增加可以增加转染活性和细胞产量。

        DNA 质量

        DNA 质量对转染效率影响非常大。一般的转染技术基于电荷吸引原理,如果 DNA 不纯,如带少量的盐离子,蛋白,代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成和转染的进行。

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