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    细胞转染的方法

    发布时间: 2021-11-25  点击次数: 756次

    细胞的转染方法



    细胞转染是指将外源分子如DNA,RNA等导入真核细胞的技术。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展,转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中,其应用越来越广泛。




    细胞转染的种类主要是瞬时转染和稳定转染,目的和区别如下所示:

    随着基因与蛋白功能研究的深入,转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例;化学介导方法很多,如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法和多种阳离子物质介导的技术;生物介导方法,有较为原始的原生质体转染和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。如下图所示:


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    下面分别介绍下原理和应用特点:



    化学转染法


    1. DEAE-葡聚糖法


    原理:带正电的DEAE-葡聚糖与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞。

    主要应用:瞬时转染

    特点:相对简便、重复比磷酸钙好,但对细胞有一定的毒副作用,转染时需除去血清。聚合物浓度、核酸或蛋白质与聚合物的比值,以及转染的持续时间是重要的优化参数,另外,此方法对附着细胞的转染非常有效,也可用于某些悬浮细胞系。(详细信息可参考文献:Gulick T .Transfection using DEAE-dextran. Curr Protoc Cell Biol. 2003 Aug;Chapter 20:Unit 20.4. doi: 10.1002/0471143030.cb2004s19.)。



    2. 磷酸钙共沉淀法


    原理:DNA与浓缩的氯化钙溶液混合,然后添加到含有磷酸盐离子的缓冲液中,形成磷酸钙-DNA沉淀物,磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞。

    主要应用:稳定转染,染瞬转染

    特点:不适用于原代细胞(所需的DNA浓度较高),操作简便但重复性差,有些细胞不适用细胞建议用CSCL梯度离心,转染时拷贝数较多。



    3. 阳离子脂质体法


    原理:带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物,然后脂质体上剩余的电核与细胞膜上的唾液酸残基的负电核结合;另一种解释是通过细胞是内吞作用而被进入细胞。(若DNA浓度过高,中和脂质体表面电核,而降低了与细胞的结合能力)。

    主要应用:稳定转染,瞬时转染,所有细胞

    特点:使用方法简单,可携带大片段DNA,通用于各种类型的裸露DNA或RNA,能转染各种类型的细胞,没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率,但在体内,能被血清清除,并在肺组织内累积,诱发强烈的抗炎反应,导致高水平的毒性,这在很大程度上限制了其应用。(生工产品编号E607403 LipoHigh 脂质体高效转染试剂)。结果如下图所示:


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    pEGFP-N1 质粒转染 Hela 细胞。转染前一天将 Hela 细胞接种于 24 孔板中,1E+5 个细胞/孔;转染前将细胞培养基换成无血清培养基,按 LipoHigh (µl):DNA (µg)= 3:1 进行转染;转染 4 小时后更换培养基为含有血清的新鲜培养基, 24 小时后,奥林巴斯 IX73 荧光倒置显微镜下观察结果。



    4. 阳离子聚合物


    原理:带正电的聚合物与核酸带负电的磷酸基团形成带正电的复合物后与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用,并通过内吞作用进入细胞。

    应用范围:稳定转染,瞬时转染,所有细胞

    特点:除了具有阳离子脂质体的转染效率高,操作简单,适用范围广,重复性好等特点外,还具有在体内,转染效率高,细胞毒性低等特点,是新一代的转染试剂。(生工产品是E607401 PolyHigh 非脂质体高效转染试剂)。结果如下图所示:

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    pEGFP-N1 质粒转染 HepG2 细胞。转染前一天将 HepG2 细胞接种于 24 孔板中,1E+5 个细胞/孔;转染更换新鲜培养基,按 PloyHigh (µL):DNA (µg)= 2:1 进行转染;转染 4 小时后更换培养基,24 小时后,奥林巴斯 IX73 荧光倒置显微镜下观察。




    病毒转染法


    1.逆转录病毒


    原理:通过病毒中膜糖蛋白和宿主细胞表面的受体相互作用而进入宿主细胞,之后反转入酶启动合成DNA并随机整合到宿主基因组中。

    主要应用:稳定转染,特定宿主细胞

    特点:可用于难转染的细胞、原代细胞,体内细胞等,但携带基因不能太大(<8kb),要求细胞要处于分裂期,需考虑安全因素。如下图所示:

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    逆转录病毒表达系统:逆转录病毒将自身基因组及其携带的外源基因随机、稳定地整合入宿主细胞基因组中,可实现目的基因稳定、长期的表达逆转录病毒表达系统根据不同的包装细胞系可分为单嗜性、双嗜性和泛嗜性,不同包装细胞产生的逆转录病毒能够特异性地感染某一个或某一类宿主细胞。该病毒包装细胞系为plat E细胞系,该细胞系包含gag、pol和env基因,因此转染单一表达质粒就可以包装出逆转录病毒,但是该病毒具有很强的针对性。(图片来源于网络)



    2.腺病毒


    原理:先和细胞表面的受体结合,继而在αv整合素介导下被细胞内吞

    主要应用:瞬时转染,特定宿主细胞

    特点:可用于难转染的细胞,需考虑安全因素。如下图所示:

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    腺病毒表达系统:一种很常用的哺乳动物病毒表达系统;但与慢病毒不同的是,腺病毒基因组及其携带的外源基因不会整合入宿主细胞的基因组中,而是游离于宿主基因组外独立表达,因此可实现目的基因瞬时、高丰度的表达,同时还避免了因整合而引发的潜在的基因突变和随机效应,安全性和可控性高。(图片来源于网络)




    物理转染法


    1.基因枪粒子轰击法


    原理:将DNA用显微重金属颗粒沉淀,再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞,DNA在胞内逐步释放,表达。

    主要应用:瞬时性转染,稳定转染

    特点:可用于人的表皮细胞,纤维原细胞,淋巴细胞系以及原代细胞。对应的结果如下图所示:

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    HEK 293细胞术后即刻激光共聚焦扫描显微照片

    用Cy3标记的siRNA包裹的直径为1.0μm的金粒子在100psi的氦气压力下进行轰击。Cy3标记siRNA上样:2μg/mg金粒子,a)透射光图像,b)共焦荧光图像,c)合并图像。白色箭头显示金颗粒。红色区域代表Cy3标记siRNA的分布。(图片来源于Masaki Uchida,Transfection by particle bombardment: Delivery of plasmid DNA into mammalian cells using gene gun .Biochimica et Biophysica Acta 1790 (2009) 754–764)。



    2. 显微注射法


    原理:用显微操作将DNA直接注入靶细胞核。

    主要应用:稳定转染,瞬时转染

    特点:转染细胞数有限,多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞。下面是报道的一篇注射法转染的结构图:

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    eGFP和mCherry质粒注射

    (a) 以1:1的比例注射eGFP和mCherry质粒混合物的HFF细胞。(b) 用eGFP和mCherry质粒的混合物以9:1的比例注射HFF细胞。(来源于文献:Chow YT,Single Cell Transfection through Precise Microinjection with Quantitatively Controlled Injection Volumes.Sci Rep. 2016 Apr 12;6:24127. doi: 10.1038/srep24127.)



    3. 电穿孔法


    原理:将细胞短暂暴露于电场中,高脉冲电压破坏细胞膜电位暂时穿孔,DNA通过膜上形成的小孔可以吸收外来的遗传物质,此方法也适用于传递蛋白质。

    主要应用:稳定转染,瞬时转染,所有细胞

    特点:适用性广,除了质粒外,还可转染大的基因组(>65kb)但细胞致死率高,DNA和细胞用量大, 需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件,拷贝数较少(1-20)。(详细的信息可以参考文献Potter, H., & Heller, R. (2018). Transfection by  electroporation.Current Protocols in Molecular Biology, 121, 9.3.1–9.3.13. doi:10.1002/cpmb.48)。




    理想细胞转染方法,应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术,是目前最高转染效率的方法,同时具有细胞毒性很低的优势。但是,病毒转染方法的准备程序复杂,常常对细胞类型有很强的选择性,在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法,则各有其特点。需要指出的一点,无论采用哪种转染技术,要获得最优的转染结果,可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多,从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态,到转染方法的操作细节,都需要考虑。目前实验室可行的最主要的细胞转染方法是脂质体转染法。







    脂质体转染法操作步骤


    1. 准备细胞(24 孔板为例): 

    a) 贴壁细胞:转染前18~24小时,用500 µl 不含抗生素的培养基接种0.5~2E+5 个细胞于24孔板中,并将细胞培养板置于37°C,5% CO2培养箱培养,转染前细胞密度达到70~90%为理想状态(具体密度视细胞的不同可进行适当调整)。 

    b) 悬浮细胞:在准备转染前,用500 µl不含抗生素的培养基接种4~8E+5个细胞即可。 

    2. 准备转染工作液: 

    a) 将 0.8~1 µg质粒DNA溶于50 µl细胞培养基中,轻轻混匀,室温静置5 min; 

    b) 将 2~3 µl 的转染试剂溶于50 µl细胞培养基中,轻轻混匀,室温静置 5 min; 

    c) 将上步含有转染试剂的培养基加入含有质粒DNA的培养基中,轻轻混匀,室温静置 20 min; 

    3. 将上述转染混合液,逐滴滴入接种好的细胞中,轻轻混匀后置于37°C,5% CO2培养箱中进行培养; 

    4. 4~8 小时后,更换新鲜培养基继续培养; 

    5. 转染24~48小时后,观察或收取细胞。如果筛选稳定细胞株,则在转染24小时后将细胞按1:10或更高的比例接种到新鲜培养基中,第二天加入选择培养基筛选。




    参考文献

    1. Gulick T .Transfection using DEAE-dextran. Curr Protoc Cell Biol. 2003 Aug;Chapter 20:Unit 20.4. doi: 10.1002/0471143030.cb2004s19.

    2. Masaki Uchida,Transfection by particle bombardment: Delivery of plasmid DNA into mammalian cells using gene gun .Biochimica et Biophysica Acta 1790 (2009) 754–764

    3. Chow YT,Single Cell Transfection through Precise Microinjection with Quantitatively Controlled Injection Volumes.Sci Rep. 2016 Apr 12;6:24127. doi: 10.1038/srep24127.

    4. Potter, H., & Heller, R. (2018). Transfection by  electroporation.Current Protocols in Molecular Biology, 121, 9.3.1–9.3.13. doi:10.1002/cpmb.48



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