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    我的siRNA怎么了?

    发布时间: 2021-12-01  点击次数: 680次

    这一期,我们来说一下siRNA转染和干扰效果不佳的问题。


    要保证RNA干扰的效果就必须保证siRNA能够成功的转染到细胞中去,那有时候会转染不进去,原因可能有如下几点:


    1、转染方法:转染siRNA浓度太低。FAM验证转染效率时siRNA(FAM)的量的终浓度是50-150nM都可以,需要根据细胞进行摸索。lipo-2000的量和使用的siRNA量成比例的,一般用1:1的效果好一些。

    建议用24孔板摸索条件。siRNA 所加的量及其浓度可以根据实验自己调整,按照要求配成20uM的浓度,那1ul就是20pmol,在1ml细胞培养液中加1ul,那终浓度就是20nM,加2ul就是40nM,以此类推。24孔板摸浓度后,用6孔板时把转染体系相应放大即可。

    实验中需要注意细胞状态要好,代数不要大,细胞密度适中,50%左右(根据的细胞生长情况调节),铺板时要铺均匀,添加转染复合物时要小心滴加。转染时建议不要使用双抗和血清,双抗转染时对细胞有毒性,会导致细胞状态不好,血清会降低转染效率。


    2、转染试剂:转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献,通过这些资料可选择较为适合实验设计的转染试剂。可能细胞对LIP2000不是太敏感,如果是这样,建议更换其他的转染试剂


    3、细胞原因:

    a、和细胞状态、细胞代数、细胞密度等有关,一般低的细胞代数(<50)能确保基因型不变。较为适合转染的细胞是经过几次传代后达到指数生长期的细胞,细胞生长旺盛,最容易转染。细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变,总染色体重组或基因调控变化等而演化。这会导致和转染相关的细胞行为的变化。也就是说同一种系的细胞株,在各实验室不同培养条件下,其生物学性状发生不同程度的改变,导致其转染特性也发生变化。因此,如果发现转染效率降低,可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳结果


    b、有的细胞不太好转染,比如悬浮、干细胞、原代等,可查找相关文献,看别人做这种细胞时用的什么方式。如果细胞不好转,就要考虑换一种方式进行您的实验了,比如说用病毒、电转等。



    转染前列腺癌细胞后拍的图片,转染进去的整个细胞是绿色的,可以清晰的看到细胞形态,没有转染进去的就是绿色的小点儿。

    如果通过上边的问题验证到siRNA的确是可以转染进细胞,但干扰效果又不理想的话那么可能的原因来了:


    1、转染效率问题,如果少量siRNA进入细胞,作用于基因后,有时候细胞会有补偿机制,表达量反而升高。建议在实验前,先检测一下转染效率,观察一下,转染进去的整个细胞是绿的,没有转染进去的是一些绿色的小点粘附在细胞上,发的光是点状的。转染进去的整个细胞是绿色的,可以清晰的看到细胞形态,没有转染进去的就是绿色的小点儿,建议多做几个转染梯度,找到最佳转染条件。

     

    2、检测时间点,建议转染后24-48小时检测基因水平变化,48-72小时检测蛋白水平变化。不同基因的半衰期是不同的,siRNA干扰是抛物线形的,多做几个时间点有利于siRNA干扰效果的测定

     

    3、推荐RT-PCR的引物应该设计在target位置的两侧,而不是同侧。目前已经知道的siRNA介导的基因knockdown机制是RSIC先介导靶mRNA的切割,切割导致靶mRNA的降解,由于切割和降解可能具有不同的时间点,因此,设计于同侧的PCR引物可能导致假阴性结果或knockdown效率的低估。

     

    4、RNA降解,建议-20保存,溶解后要最小量分装,-20最好-80保存,3个月内用完,避免反复冻融或者4度保存。干粉保存最长不要超过6个月

     

    4、基因问题。有的基因受细胞调控比较严格,mRNA能敲除,但是蛋白水平敲除不下来的,如果这样,建议换一种细胞看看

     

    5、干扰靶点不合适。需重新设计siRNA。


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