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    细胞冻存与复苏的正确操作方法

    发布时间: 2021-12-02  点击次数: 1135次

    细胞冻存与复苏,是细胞培养过程中的常见工作。



    细胞冻存,是指将细胞贮存在超低温环境中,使细胞暂时“冬眠"的技术,在需要的时候再进行复苏。


    细胞复苏,是把冻存在-80℃冰箱或液氮中的细胞快速解冻,并使细胞重新恢复生长的技术。


    本文将为大家介绍细胞冻存与复苏的技术要点和操作步骤。 


    细胞冻存篇


    冻存原则


    冻存原则为“慢冻",即让细胞在缓慢降温的条件下逐渐冷冻。


    如果直接将细胞悬液放在超低温下快速冷冻,细胞会受到冷冻损伤而死亡。在冻存液中添加的保护剂(如DMSO、甘油)和在冻存盒中添加的异丙醇,都起到程序性降温的作用。


    DMSO使用注意事项


    DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中,延缓温度下降速度,减少细胞内冰晶的形成,从而起到保护细胞的作用。


    需注意的是,DMSO溶于培养基时,将释放大量热量,所以冻存液需提前配制,不能直接将DMSO加入含有细胞的培养基中,避免烫伤细胞。


    另外,DMSO属于致癌物质,使用时应戴好手套,规范操作。


    程序冻存液配方


    程序冻存液成分一般由基础培养基、胎牛血清、DMSO组成。血清比例为10%~90%,DMSO比例为5%~10%。根据普诺赛实验室经验,推荐冻存液配比:55%基础培养基+40%胎牛血清+5%DMSO,难养细胞可用90%胎牛血清+10%DMSO冻存。


    细胞冻存密度


    细胞冻存和复苏过程中,不可避免会损失部分细胞,所以冻存的密度不能太低。提高冻存密度有助于提升复苏存活率,推荐密度为100~300万细胞/mL。


    冻存操作方法


    方法一:使用程序冻存盒 



    使用程序降温盒是较为常用的冻存方法。市面上的降温盒有些需要添加异丙醇,有些则不需要。


    降温盒须恢复室温后再使用。


    根据普诺赛实验室经验,使用程序冻存盒冻存效果良好,没有冻存盒的同学可以参照下文方法二和方法三。


    操作步骤

    步骤1:配制程序冻存液,放在室温备用或放在4℃预冷

    步骤2:离心收集对数生长期的细胞(贴壁细胞消化下来离心,悬浮细胞直接离心,转速1200rpm或250g,时间3min)

    步骤3:用配制好的冻存液重悬细胞,按照1~1.5mL/管分装到冻存管中,拧紧管盖,做好标记

    步骤4:冻存管放入冻存盒,冻存盒放入-80℃冰箱过夜(24h)

    步骤5:冻存管从冻存盒取出,转移至液氮长期保存


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     ▲ 使用冻存盒操作示意图


    方法二:使用无血清非程序冻存液 



    无血清非程序冻存液是一种商品化的冻存液,无需自己配制,无需降温盒,大大提升了便捷性。


    但是,并非所有细胞都适用于这种冻存液,使用前必须做冻存测试,没问题后再批量应用。


    操作步骤

    步骤1:从冰箱拿出无血清非程序冻存液,待用

    步骤2:离心收集对数生长期的细胞(贴壁细胞消化下来离心,悬浮细胞直接离心,转速1200rpm或250g,时间3min)

    步骤3:弃上清,加入适量无血清非程序冻存液,重悬细胞

    步骤4:按照1~1.5mL/管的量分装到冻存管中,拧紧管盖,做好标记

    步骤5:将冻存管直接移入-80℃冰箱中,24h后转移至液氮长期保存


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    ▲ 使用无血清非程序冻存液操作示意图


    方法三:手动梯度降温 



    在没有冻存盒或者非程序冻存液时,可以选择手动梯度降温。但手动梯度降温不适用于所有细胞,且效果不稳定,同样需要先做冻存测试。


    操作步骤

    步骤1:配制程序冻存液,放在室温备用或放在4℃预冷

    步骤2:离心收集对数生长期的细胞(贴壁细胞消化下来离心,悬浮细胞直接离心,转速1200rpm或250g,时间3min)

    步骤3:用配制好的冻存液重悬细胞,按照1~1.5mL/管分装到冻存管中,拧紧管盖,做好标记

    步骤4:冻存管按照【4℃(20min)→-20℃(30min)→-80℃(24h)→液氮】的顺序放置


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    ▲ 手动梯度降温操作示意图


    细胞复苏篇


    复苏讲究“快融",越快融化,细胞所受损伤就越小。细胞复苏的操作不复杂,但每一步都必须稳扎稳打,才能最大限度地提高复苏存活率。


    复苏步骤


    步骤1:水浴锅预热至37℃备用


    步骤2:准备15mL离心管,并向其中加入适量培养基待用

    小贴士:离心管中加入2~9mL的培养基,比较难养的细胞,可适量增加培养基。


    步骤3:将细胞冻存管从-80℃冰箱或液氮中取出,放入PE手套中,迅速投入水浴锅

    小贴士:如果冰箱或液氮距离水浴锅路途较远(步行超过1min),要把细胞先置于干冰上,再送至水浴锅。如果将细胞冻存管直接放在手上或口袋里,可能导致温度逐渐回升而产生冰晶损伤细胞。而将细胞冻存管装在PE手套中,是为了预防污染。


    步骤4:用力摇晃冻存管,使其在1分钟内融化

    小贴士:这一步越快融化越好,最好能放计时器在旁边。如果1分钟内没有融化,可能是冻存液量偏多,或者摇晃力度不够。


    步骤5:用纸巾擦拭水渍,转移至生物安全柜。用移液枪吸取细胞悬液,缓慢滴加到步骤2中准备好的离心管


    小贴士:当同时复苏多管细胞时,注意不要弄混。


    步骤6:1200rpm离心3分钟

    小贴士:离心是为了去除DMSO,对于DMSO敏感的细胞,必须离心;若复苏的细胞对DMSO不敏感,步骤6、步骤7可以省略,直接将培养基补足至10mL,接种至培养器皿中,第二天换液。


    步骤7:弃上清,用新鲜培养基重悬细胞,接种至新的无菌培养器皿中


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    ▲ 细胞复苏操作示意图


    做完步骤7,细胞就复苏好了。复苏的细胞需要一段时间恢复状态,复苏后的细胞密度低于80%时,48小时内不要换液,待细胞形态、生长速度等恢复正常,再进行传代等操作。(不要因为复苏后两三天细胞状态不好就丢弃,应耐心等待至少一周。)


    当然,复苏后细胞状态很好的情况下,可以提前开始实验。



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