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    THP-1细胞培养秘籍给有需要的您

    发布时间: 2021-12-02  点击次数: 701次

    THP-1细胞系是1980年Tsuchiya等人建立的人单核细胞白血病细胞系。它来自一位急性单核细胞白血病患者的血液,有分化为多种巨噬细胞的能力,是各领域研究常用的细胞系之一。                    



    THP-1细胞基本信息


    细胞名称

    THP-1 (人单核细胞白血病)

    细胞别称

    THP1; THP 1; THPI; THP-1; 

    Tohoku Hospital Pediatrics-1

    种属

    组织来源

    急性单核细胞白血病,单核细胞

    生长特性

    悬浮细胞

    细胞形态

    单核细胞

    生长培养基

    RPMI-1640+10% FBS+0.05mM β-mercaptoethanol+1% P/S

    培养环境

    气相:95%空气;5%CO2

    温度:37℃

    推荐传代比例

    1:2-1:4

    冻存液配方

    90%FBS+10%DMSO


    THP-1细胞的特点


    喜欢酸性环境

    在偏酸性环境中,THP-1生长更快,所以当培养基稍微变黄(呈橘红色)时,是适合细胞生长的,此时补液或半换液即可。(详细操作见下文换液篇)


    有密度依赖性

    THP-1细胞密度低时,生长较慢,培养密度维持在50万-100万细胞/毫升为宜;超过200万/毫升则需要传代。


    对血清要求高

    选择品质好的血清更有利于THP-1细胞生长。


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    ▲ THP-1生长图片


    培养攻略之收货篇


    常温细胞


    收到细胞后,放进培养箱静置2-4小时,之后将瓶中培养基全部离心(1200rpm或250g,3分钟),去上清,用适量新鲜培养基重悬细胞,按比例接种到新培养瓶中。


    冻存细胞


    收到细胞后,如果不复苏,放进-80℃冰箱暂存或放进液氮长期保存。如果复苏,按照常规复苏步骤操作(见下文复苏篇)即可。


    小贴士:由于THP-1有密度依赖,将培养瓶竖着放进培养箱(瓶盖朝上),可以增加细胞局部密度,从而促进细胞生长,注意瓶盖要保持透气。


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    ▲ 常温THP-1细胞,收货处理示意图


    培养攻略之换液篇


    补液法


    培养基变黄时可补加适量(1~2mL)新鲜培养基,补加1-2次之后,用离心的方式全部换液,离心1200rpm (约250g)3分钟。


    半换液法


    以T25瓶子为例,瓶子里装有5mL培养基。竖起瓶子静置一段时间,待细胞沉底,小心吸出2.5mL的培养基,转移到离心管,离心1200rpm (约250g)3分钟,检查有没有沉淀,以免损失细胞;原瓶补充2.5mL新鲜培养基,离心管里若有细胞,则用新鲜培养基重悬后放回原瓶。


    小贴士:如果换液后第二天培养基就变得很黄,同时镜下检查未污染,说明细胞密度大,该传代了。


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    ▲ 半换液操作示意图


    培养攻略之传代篇


    直接分瓶法


    摇晃培养瓶,把细胞摇匀,均分到两个瓶子里,每瓶再补充等量培养基。


    离心


    离心后计数,按照40-50万细胞/mL的密度接种到T25瓶里,瓶中培养基量以5mL为宜。不方便计数时,按1:2比例传代。


    小贴士细胞碎片较多的情况下,建议用离心法传代,离心转速可适当降低(推荐800~1000rpm或160~200g)。


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    ▲ 传代时机


    培养攻略之冻存篇


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    冻存步骤


    1. 预先配制好冻存液

    2. 细胞1200rpm(约250g)3分钟离心后

    3. 去上清,用配好的冻存液重悬细胞

    4. 转移入冻存管

    5. 冻存管放进程序冻存盒

    6. 冻存盒放进-80度冰箱过夜,再放液氮长期保存


    小贴士:

    1. 由于THP-1是悬浮细胞,更易受到冻存影响,建议加大冻存密度,大约200万-300万/mL为宜,以提高复苏存活率。

    2. 没有程序降温盒的同学,可以选择非程序冻存液(使用前咨询试剂商是否适用于THP-1,并做冻存测试),或者按照【4℃ 20min→-20℃ 30min→-80℃ 过夜→液氮保存】的顺序手动梯度降温。


    培养攻略之复苏篇


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    复苏步骤


    1. 预热水浴锅至37℃

    2. 准备一个15mL离心管,加入2-3mL左右完全培养基待用

    3. 将细胞从-80℃冰箱或液氮中取出后,放进一次性PE手套中,立即投入水浴锅,迅速用力摇晃管子,使其1分钟内融化

    4. 酒精擦拭冻存管,进入生物安全柜,把融化的细胞悬液缓慢滴加到步骤2准备好的离心管中

    5. 1200rpm(约250g)离心3分钟

    6. 同时准备1个新的T25培养瓶,加入5mL完全培养基

    7. 去上清,新鲜培养基重悬细胞后滴加到步骤6培养瓶里,放入培养箱


    小贴士:THP-1细胞复苏后通常需要3-5天恢复状态,建议复苏后48小时内不要进行操作。


    常见问题及解决方案


    N.1

    收货时细胞出现伪足,或是碎片较多怎么办?

    受到运输影响,悬浮细胞会短暂性出现形态改变的现象,如伪足等。通过传代培养,1周左右可以恢复正常。一些细胞在运输途中死亡而产生碎片,通过传代离心可以去除(见上文传代篇)。


    NO.2

    培养过程中细胞发生贴壁怎么办?

    少量细胞贴壁属于正常情况,将细胞悬液转移至新瓶中即可。当贴壁细胞的比例高于20%,说明细胞生长环境有异常,需排查培养箱设置、培养基成分,以及培养器皿是否异常。


    NO.3

    培养过程中细胞发生聚团怎么办?

    少量细胞聚团,呈葡萄串状,属于正常现象,特别是细胞密度较低时,易出现这种情况。更换血清品牌或增大血清比例(不超过20%)有助于解决聚团问题。不建议将聚团的细胞吹散,等待密度高时,会自己分散开。


    NO.4

    培养基里一定要加β-巯基乙醇吗?

    β-巯基乙醇是一种常用的培养补充剂,有抗氧化的作用,可减少氧化应激对THP-1细胞的影响。当细胞密度过大但需要维持时,可适当增加巯基乙醇的比例(不超过标准量的1.5倍)。


    NO.5

    镜下观察时,难以聚焦或估算密度怎么办?

    悬浮细胞会随着液体流动,不容易聚焦,静置5-10分钟使细胞沉底,之后再轻轻放上显微镜观察,将有助于聚焦和估算细胞密度。


    图片

    ▲ 严重聚团的THP-1细胞



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