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    大鼠星型胶质细胞培养实验——酶消化法

    发布时间: 2021-12-05  点击次数: 364次

    材料与仪器

    Wistar大鼠乳鼠
    FBS DMEM 胰蛋白酶 EDTA 酒精
    眼科剪 滴管 离心机 培养皿 CO2培养箱

    步骤

    一、实验步骤

    1. 新生1-2 天Wistar大鼠乳鼠,经75%酒精消毒,断头处死。
     
    2. 取脑放入冷的D-Hanks'平衡盐溶液,去除脑膜及大血管。
     
    3. 分离两侧大脑皮质并剪成1mm3 大小,加入0.25%胰蛋白酶37℃空气浴震荡消化10 min。
     
    4. 用含10% FBS的DMEM培养基终止消化,离心(1 000 rpm,10 min),去上清。
     
    5. 用含10% FBS的DMEM培养基重悬沉淀,经75μm筛网过滤,收集滤液,再次离心10 min,收集沉淀用含10% FBS的DMEM培养基重悬,调整细胞密度至1.5x106/ml,种植于75 cm2 培养瓶。
     
    6. 经1 小时差速黏附去除成纤维细胞后,将细胞悬液转移到一新的75 cm2 培养瓶继续培养,两天换液一次。
     
    7. 7 天后将培养瓶放入水平摇床(260 rpm,2 h,37℃),换液弃除小胶质细胞,放入培养箱平衡1 小时,重新置于水平摇床18 h。
     
    8. 换液弃除少突胶质细胞,用新鲜培养基洗2 遍,加入0.25%胰蛋白酶与0.02% EDTA 1:1 混合液消化、传代备用。
     
    二、 形态学观察

    倒置相差显微镜下观察细胞形态和生长状况。
     
    三、 细胞生长曲线绘制

    传代后的细胞以 2x104/ml 的密度种植于24 孔培养板中培养,3 天换液1 次, 每24 小时取3 孔计数,连续7 天,取均值绘制生长曲线。
     
    四、星型胶质细胞的鉴定

    胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞组织化学鉴定方法。取星型胶质细胞去除培养基,用PBS洗3 遍,4%多聚甲醛室温固定1 小时,PBS洗3 次,每次5 分钟,0.3% H2O2 30 分钟以去除内源性过氧化物,PBS洗3 次每次5 分钟,加含0.5% Triton X-100 的山羊血清封闭30 分钟,滴加兔抗GFAP 抗体(1:75),4℃ 18 小时,PBS洗3 次每次5 分钟,滴加生物素标记羊抗兔IgG,室温20 分钟,PBS洗3 次,每次5 分钟,滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液,室温20 分钟,PBS洗3 次,每次5 分钟,DAB显色。
     五、结果

    1. 形态学观察:光镜下,传代的星型胶质细胞折光性强,形状不规则,主要为多角形,胞体大而扁平、胞质丰富,细胞核圆形或卵圆形,偏于胞体一侧,内有1-2 个核仁,有多个粗短枝状初级胞突,部分细胞突起变细变长,6-7 天后细胞融合成单层,符合神经胶质细胞生长特性,如下图。
     

    星型胶质细胞单层生长(x100)

    图1:星型胶质细胞形成融合状,单层生长(x200)
     
    2.  鉴定:细胞经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色98%以上均为细胞浆着色,而胞核未见着色,见下图,证明采用上述方法获得的细胞为星型胶质细胞,纯度高, 可用于实验。

    图2:免疫组化鉴定,GFAP 染色

    3. 细胞生长曲线绘制如下:

    图3:细胞生长曲线


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