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    大鼠大脑皮层神经元细胞培养实验——酶消化法

    发布时间: 2021-12-05  点击次数: 353次

    材料与仪器

    小鼠
    酒精 解剖液 胰蛋白酶 DMEM F12 B27 阿糖胞苷培养液
    培养箱

    步骤


    一、小鼠大脑皮层神经元原代培养步骤

    1.  于无菌条件下切取鼠头并以75%酒精浸泡1 min,解剖出完整鼠脑。

    2.  预冷解剖液中分离去除软膜、血管、取大脑皮质漂洗,用眼科剪将皮质反复剪切成碎块。

    3.  移入培养皿中,吸除解剖液加入0.25%胰蛋白酶2 ml,37℃培养箱中消化30 min。

    4.  将皮层组织碎块移入离心管,弃去剩余消化液,用接种液洗3次,每次洗涤后使组织块充分沉降到试管底,弃去上清液。

    5.  最后再用接种液1 ml混悬,反复吹打(巴氏吸管)混悬液中组织块,力度适中,至浑浊后将上清液移入培养瓶待用。

    6.  加入1ml接种液后再次吹打,如此反复3-4次,组织块逐渐消化后,弃去最终残块。

    7.  收集含单细胞悬液的上清液约4-5 ml于培养瓶中,以接种液重新悬浮细胞,细胞记数;接种1x107个细胞于6孔培养板中。

    8.  培养24 h至细胞贴壁后,换全培养液(DMEM/F12+2%B27)培养3d,观察神经元生长状况。

    9.  换用阿糖胞苷培养液、  每隔3d换全培养液1次,每次换半液。

    二、神经元免疫化学鉴定

    1.  4%多聚甲醛固定细胞30 min,PBS洗涤3次。

    2.  加入无水甲醇:30%双氧水(5:1)处理30 min,PBS洗涤3次。

    3.  加入5%羊血清封闭20 min,弃去多余液体。

    4.  加入Rabbit Anti-NSE(1:100)(神经元特异性烯醇化酶),培养箱中孵育2-4 h,PBS洗涤3次。

    6.  加入DAPI染液(1:40),室温放置5-10 min;PBS洗涤3次。

    7.  荧光显微镜观察。 

    三、结果      


    图1: 刚接种时细胞图

    图2: 刚接种时细胞图培养1d后

    图3: 刚接种时细胞图培养2d后

    图4: 刚接种时细胞图培养3d后

    图5: 刚接种时细胞图培养4d后


    图6: 刚接种时细胞图培养5d后


    图7: 刚接种时细胞图培养6d后


    图8:第7d免疫鉴定图


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