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    大鼠视神经少突胶质细胞培养实验——牛血清培养法

    发布时间: 2021-12-06  点击次数: 288次

    材料与仪器

    Wistar大鼠
    亚(石西)酸钠 腐胺 转铁蛋白 胰岛素 甲状腺素 黄体酮 谷氨酰胺 小牛血清 兔抗鼠GC抗体
    眼科剪 滴管 离心机 培养皿 CO2培养箱

    步骤

    一、实验步骤

    1.  取新生2 d 的Wistar大鼠10 只,无菌条件下取出双侧视神经。
     
    2.  接种至24孔培养板内经多聚赖氨酸处理的盖玻片上。
     
    3.  加入含30g·L-1 小牛血清的DMEM/F12 培养基,37℃,50mL/L CO2,100%湿度连续培养3 d 。
     
    4.  3 d 后弃废液,改为含 5g·L-1 小牛血清DMEM/F12 条件培养液继续培养。
     
    5.  每周换液2次。在获得足够的细胞数量后,改用无血清条件培养液继续培养,每2 d 换液一次。

    二、形态学观察

    每天在倒置显微镜,观察培养细胞的生长过程和形态学变化并拍照。

    三、免疫细胞化学鉴定

    1.  将含细胞盖玻片取出,0.01 mol·L-1 PBS冲洗3 次x5 min。

    2.  冷丙酮固定10 min。

    3.  PBS冲洗(3 次x5 min)。

    4.  30g·L-1 过氧化氢室温孵育15 min。

    5.  PBS冲洗3 次x5 min。

    6.  滴加正常山羊血清,室温孵育20 min。

    7.  滴加1:100 GC抗体,阴性对照以PBS代替一抗,37℃孵育60 min。

    8.  PBS冲洗3 次x5 min。

    9.  滴加 生物素标记羊抗兔IgG,37℃,20 min。

    10.  PBS冲洗3 次x5 min。

    11.  滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液。

    12.  DAB工作 液显色,自来水终止反应。

    13.  脱水,透明,DPX封片保存。

    四、结果

    1. 形态学观察结果

    组织块24 h 开始贴壁,48~72 h 可见神经组织边缘游出少量细胞,主要为圆形或梭形(图 1)。8~9 d 左右,细胞基本铺满培养孔。此时改用无血清条件培养基培养进行纯化。培养过程中,部分细胞死亡。12 d 左右获得的细胞胞体基本为呈圆形或多角型,直径约 6~10μm。细胞核较大,胞质少(图 2)。

    2. 免疫组织化学染色结果

    培养的视神经少突胶质细胞的免疫组织化学染色 GC 蛋白阳性,未加一抗的呈阴性。染色结果显示成熟的少突胶质细胞突起丰富,互相形成蜘蛛网状(图 3)。苏木素复染,异质细胞较少,90%以上为阳性细胞(图 4)。
     

    Figure 1 Cells migrated from optic nerve tissue at the third day (10x10)
    图 1. 培养第 3 天,细胞自视神经迁出 (10x10)


    Figure2 Purified oligodendrocytes of optic nerve at the fifteenth day (10x40)
    图 2. 培养第 15 天,纯化的视神经少突胶质细胞(10x40)


    Figure 3 Positive expression of GC in oligodendrocytes at the seventh day (10x20)
    图 3. 培养第 7 天,少突胶质细胞 GC 阳性表达 (10x20)



    Figure 4 Positive expression of GC in purified oligodendrocytes at the fifteenth day (hematoxylin staining) (10x20)
    图 4. 培养第 15 天,纯化的少突胶质细胞 GC 阳性表达(苏木素复染)(10x20)


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