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    大鼠胰岛细胞培养实验

    发布时间: 2021-12-06  点击次数: 271次

    材料与仪器

    一周龄Wistar 大鼠
    D-Hanks’液 胰蛋白酶 Ⅴ型胶原酶 葡萄糖 碘乙酸
    手术剪 手术钳 眼科剪刀 眼科镊子 大头针 手术刀片 培养皿

    步骤


    1. 一周龄Wistar大鼠,断颈处死,于75%乙醇浸泡15 分钟,无菌取出胰腺,于冰冷无菌D-Hanks’液中漂洗,用眼科剪仔细清除脂肪、包膜、血管等胰外组织,转入青霉素小瓶中。


    2. 加入少量无菌D-Hanks’液,用眼科剪剪成0.1-1.0 mm3 大小的碎片,用滴管轻轻吸出上层细小脂肪碎块和油滴,再用无菌D-Hanks’液反复清洗 8——10 次,加入10 倍体积无菌消化酶液[胰蛋白酶-胶原酶消化液: 0.05 g 胰蛋白酶,0.025 g Ⅴ型胶原酶(663 U/mg),0.05g葡萄糖,溶于100ml无 Ca2+、Mg2+的0.01 mol/L PBS(pH 值为 7.4)溶液,用0.22 µm 微孔滤膜滤菌],38℃±1℃消化,消化过程中不断震荡,10 分钟后弃去上清液。


    3. 用无菌D-Hanks’液将组织块清洗 2——3 次,加入新鲜酶液继续消化,重复上述步骤,此时组织块边缘模糊。


    4. 将组织块浸入消化酶液中,38℃±1℃消化10 分钟,将消化酶液与组织块分开,组织块重新加入新鲜消化酶液进行消化;而原消化酶液1500 rpm离心 10 分钟,取沉淀即为消化下的细胞,重新用无菌D-Hanks’悬浮,离心,重复 1——2 次,再用培养基洗 2——3 次,用培养基悬浮即得细胞悬液。


    5. 将消化过的组织块重复消化5——6 次至组织块消化完全,重复以上操作。


    6. 合并几次所得细胞悬液,计数,调整细胞浓度为 2×105个细胞/mL,将细胞悬液接种于24 孔塑料培养板中,每孔1 ml,置于37℃,5%CO2,饱和湿度培养箱中培养。


    7. 由于成纤维细胞贴壁要比胰岛细胞迅速,接种15 h 后,轻轻振荡培养板,将上面未贴壁的细胞接入新的培养板中,可除去部分成纤维细胞。


    8. 将新培养板中细胞培养 48 小时后,换新鲜配置的含有2.5 ng/mL 的碘乙酸的培养基培养5 h,可除去绝大部分成纤维细胞,而胰岛细胞不受伤害,换不含碘乙酸的培养基洗2次,并换不含碘乙酸的培养基在 37℃、5% CO2,饱和湿度培养箱中培养,每隔 3 天换培养液,获得单层胰岛细胞。


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