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    大鼠肝星状细胞培养技术

    发布时间: 2021-12-06  点击次数: 138次

    材料与仪器

    雄性 SD 大鼠
    戊巴(匕匕)妥钠 小牛血清 DMEM 酶消化液I、Ⅱ Nycodenz D-Hanks’液 HBSS 台盼兰
    手术器械 尼龙网 相差显微镜 荧光显微镜

    步骤


    一、实验步骤
     

    1. 大鼠腹腔麻醉后在超净台上剖腹,进行门静脉插管。
     
    2. 以D-Hanks‘液灌注,同时剪开下腔静脉,冲掉血液后,改灌以100 ml 酶消化液I(0.05% IV 型胶原酶)。
     
    3. 待肝脏变软后,离体肝脏并剪碎,继续以酶消化液II(含20U/ml DNase I 的0.05% IV 型胶原酶)消化15 min,尼龙网过滤后以450 g 离心5 min(4℃,下同)。
     
    4. 以HBSS 重悬沉淀至10 ml,再混以20 ml Nycodenz 液,分置于离心管中,并分别覆以2-3 ml HBSS,1450 g 离心16 min 后取界面细胞。
     
    5. 以HBSS重悬后再次离心收集细胞,以DMEM重悬后进行细胞计数,并判断存活率和产量,最后按照常规方法接种(105 细胞/cm2 ),次日换液,以后每2-3 天换液一次。
     
    6. 传代方法:弃去培液后以D-Hanks’液洗两次,加0.125%胰酶(原代最好加0.05% EDTA)消化,镜下观察细胞突起回缩(2-5 min左右),以完全培液(DMEM+10% NBS)终止反应(若不用EDTA,可以不需离心), 充分吹打后以 1:2-1:3 接种,然后继续培养(5% CO2,37℃)。


    二、结果

    接种次日,光镜下可见细胞呈星芒状,胞质内有脂滴,荧光镜下328  nm 处见自发荧光。附照片(图 1)。

     

    图 1. 原代培养第 2 天的大鼠肝星状细胞


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